我们都知道，在实验室里，常常有一些对实验至关重要的小技巧，但却没有人谈论。经过几个月的故障排除后，那些没有告诉你这个关键问题的人会怀疑地问:“你真的没有添加3微升5毫米八角茴香？”这是我第一次制作时所期待的CRISPR / Cas9基因编辑。我想让基因失活BRAF(一种与几种人类癌症有关的激酶)在A549细胞(一种人类肺癌细胞系)中，仅使用通过Addgene的病毒服务和科学文章的方法部分获得的病毒(喘气)。令我高兴的是，我不仅能够在没有任何试剂级濒危火星菊苣根的情况下进行编辑，而且考虑到这是一个大海捞针类型的目标，这是令人惊讶的容易。这是真的，我CRISPRed。在这篇文章中，我将总结基本步骤和分析，并给出我认为使用Addgene的慢病毒CRISPR工具执行和分析基因编辑的每一步的主要提示。
Cas9交付
概述在任何编辑开始之前，我们需要我们的A549细胞表达Cas9。在这些特定的实验中，我们通过Cas9慢病毒载体的转导，生成稳定表达Cas9的A549细胞，lentiCas9-Blast（52962 - lvF图1)。一些细胞随后被用来通过有限稀释法获得单克隆细胞系．其余的细胞都被冷冻了。
专业人员:
1.这都是关于MOI的。回想起来，考虑到A549细胞相对容易转导，我使用了太高的Cas9 MOI。我最终得到了每个细胞太多的Cas9整合，而我稳定的细胞池中Cas9表达差异很大（图1）这是一个问题，因为Cas9的表达会影响生长速度，所以我的细胞池会随着时间的推移而进化，这对于重复性来说是个坏消息，对于筛查来说也是个坏消息。因为Addgene病毒是以特定的滴度提供的，所以你可以更好地计划你的转导，并使用一系列合理的MOI。
2.建立一个单克隆Cas9表达细胞系。特别是如果你正在做一个筛选的话。我制作了一些单克隆细胞系（图2），我很惊讶Cas9表达在不同的细胞中是多么的可变（图3）。
3.在制造单克隆系方面:我以前从来没有做过，第一次成功可能是因为我用了一个强壮的细胞系。如果你的细胞是敏感的，让它们长出来可能会更困难。唯一的缺点是单个细胞需要几周的时间才能生长出来。然而，由于细胞生长缓慢，不需要太多的维护。在96孔的盘子里发现独立的殖民地也很有趣。我的协议和许多额外的技巧可以找到在这里．
检查Cas9表达式
概述：通过westernblotting（图2，pool），我知道细胞表达Cas9，但我不知道哪种表达水平对基因编辑最有效。一种编码GFP的病毒加上靶向GFP的gRNA(pXPR_011,59702 - lv)用于检测我稳定的A549细胞池中Cas9的活性。使用该病毒，预计在病毒传递GFP gRNA的引导下，Cas9活性将编辑出病毒传递的GFP基因。因此，没有Cas9的细胞应该是绿色的，而有功能Cas9的细胞应该不那么绿色。注意，并不是所有细胞都进行统一编辑，所以尽管Cas9活跃，一些细胞仍然显示为绿色(见提示2)。
专业人员
1.要用这种方法量化Cas9活性，你真的需要使用FAC（就像他们在原始出版物中所做的那样）。我以为我可以用荧光显微镜看到GFP的表达，但GFP的表达非常低（即使在缺乏Cas9的转导野生型A549细胞中，也应该表达GFP）我不能得到一个好的图像。你可能也可以对GFP表达进行免疫印迹，但我没有。
2.在最初发表的论文中，他们发现大约20%的cas9表达细胞中有GFP表达。因此，即使在Cas9有效编辑时，也不要期望100%的敲除人群。
BRAF gRNA交付
概述：实际上，你会选择“编辑效率最高”的Cas9行来引入gRNA，但我只是随机选择了我的一个稳定池。包含BRAF gRNA的病毒（BRDN0000561167和BRDN0001146266）（76479 - lv和76480 - lv)或控制GFP gRNA (BRDN0000561167)（80034 - lv)单独用于转导稳定的Cas9-A549细胞库，MOI为0.3，如原始出版物推荐的。
Pro-Tip:
1.使用多个grna来针对你基因的不同区域。我用的是现有的BRAF gRNA病毒，但你可以找到验证gRNA质粒在我们的网站上。用多个grna靶向基因的不同区域有几个原因，但最重要的是，通过比较多个grna的表型，可以避免潜在的脱靶伪象。针对基因的不同区域也很有用，以防基因有你不知道的奇怪突变(这可能影响gRNA的结合能力)。
使用检测者分析验证基因组编辑
概述：我使用Surveyor分析方法在我的特定gRNAs靶向的BRAF位点上寻找基因组编辑(图4)。分析中最困难的部分是设计基因组DNA编辑侧边的引物，并对基因组DNA进行PCR。测量员分析本身相对容易。
检测者分析的基础是检测者核酸酶在碱基对错配时切割双链DNA（dsDNA）。要使用此工具检测BRAF基因编辑，只需从编辑的细胞中PCR扩增BRAF基因座（PCR产物应包含编辑的BRAF序列），然后从对照细胞中PCR扩增BRAF基因座（PCR产物应包含野生型BRAF序列）。然后，混合PCR产物并使用温度变性和复性双链DNA。复性后，您将生成DNA双链体，其中一条来自编辑的细胞，另一条来自控制细胞，其中应包含编辑部位的碱基对错配。使用核酸酶和凝胶电泳，这些不匹配通过DNA切割产物的存在来表示。
428个基点乐队的外观显示编辑在BRAF-gRNA BRAF基因转导的细胞,在细胞转导并没有这样的编辑控制GFP-gRNA(图4、5)。这种凝胶曝光过度时,我甚至可以看到85个基点产品底部的凝胶在BRAF gRNA-transduced样本(数据未显示)。
专业人员:
1.设计针对基因组DNA的引物以扩增gRNA靶点具有挑战性，因为你受到人类基因组序列的限制。我用了UCSC基因组浏览器和Primer3设计引物扩增500-600 bp的产物。我设计的引物(上面列出的)效果很好，在上述条件下我得到了清晰的条带。
2.设计引物，使消化位点不在PCR产物的中间。如果不匹配是在PCR产物的中间，你会期望两个同样大小的消化产物（将在凝胶上共同迁移）而不是两个不同大小的消化产物（这可以更容易可视化和识别）。如果你需要/把消化位点放在PCR产物的中间，你仍然能够识别解理产物。
3.的测量工具对第一次使用的用户有很多好的建议，我都遵循了。如果你以前从未用过这个方法，考虑一下他们的建议，包括:
- 在用Surveyor核酸酶消化DNA双链之前，保存一些双链并将其作为未消化的对照。有时PCR产物看起来是污迹，所以有一个未消化的对照可以帮助区分污迹和模糊的消化产物。此外，取决于你的细胞中基因编辑的程度和测量者消化反应的效率，消化的产物可能是有限的和微弱的，所以有尽可能多的控制来确认你的结果是有用的。(图5)。消化产物(图4，车道0.3% 3.0，图5，车道2)比较微弱，因此与未消化对照(图4，车道0，图5，车道1)比较，可以确定它是真正的消化产物，而不是另一个PCR产物。
4.在优化反应和确认带的存在之后，你可以运行另一种凝胶来突出重要的结果(例如，如果你需要用数据做一个数字)。用丙烯酰胺代替琼脂糖可以得到更清晰的条带。我比较了gRNA转导的两个MOIs，看看这是否对编辑效率有影响，它没有(图4)。
5.理论上，你可以使用密度分析来定量凝胶上的条带的强度，并了解有编辑的细胞在人群中的百分比。我没有这样做，但要做到这一点你需要一个非常好的凝胶图像。如果你在分析短的DNA片段，使用PAGE而不是琼脂糖来获得更清晰的条带。
结论
总的来说，用基因敲除技术制造人类细胞系是很简单的，这也证明了基因组工程已经走了多远。相比之下，在2007年，使用基于同源重组(Rago等人，2007年）.使用CRISPR，我能够在大约1个月内敲除人类癌症细胞系中的BRAF，我认为这是相当惊人的。尽管研究机会不断变化，但身处实验室仍是令人兴奋的时刻。基于现有技术的力量，以及分享信息和董事是多么快速和容易，这是令人兴奋的想法，无论你是谁你可能很快就会开始进行新的科学观察。
参考文献
1.人类体细胞的基因敲除和敲入。自然的协议2007;2(11): 2734 - 46所示。PubMedPMID: 18007609．
Addgene材料
1.lentiCas9-Blast (质粒#52962)这是张峰的礼物，在CRISPR筛选的改良载体和全基因组文库中有描述。Sanjana NE，Shalem O，Zhang F.Nat方法。2014年8月；11(8):783-4. 内政部：10.1038/nmeth.3047。10.1038/nmeth.3047。PubMedPMID: 25075903．公共医学中心PMCID: PMC4486245．
2.pXPR_011 (质粒# 59702)是John Doench&David Root的礼物，在CRISPR-Cas9介导基因失活的高活性sgRNAs的合理设计中有描述。Doench JG、Hartenian E、Graham DB、Tothova Z、Hegde M、Smith I、Sullender M、Ebert BL、Xavier RJ、Root DE.Nat Biotechnol.2014年9月3日。doi:10.1038/nbt.3026.10.1038/nbt.3026 PubMedPMID:25184501．公共医学中心PMCID:pmc426738．
3.EGFP gRNA (BRDN0000561167) (质粒# 80034)和BRAF gRNAs (BRDN0001145345和BRDN0001146266) (质粒# 76479和# 76480)是John Doench和David Root的礼物，并在优化的sgRNA设计中进行了描述，以最大化CRISPR-Cas9的活性和最小化脱靶效应。Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, Smith I, Tothova Z, Wilen C, Orchard R, Virgin HW, Listgarten J, Root DE. Nat Biotechnol. 2016 1月18日。doi: 10.1038 / nbt.3437。PubMedPMID: 26780180．公共医学中心PMCID: PMC4744125．
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资源在Addgene.org
网站
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- UCSC基因组浏览器：用于重新填充基因组DNA
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