本文由客座博主萨曼莎·杨贡献。
的使用CRISPR / Cas9因为基因编辑自2012-2013年适应用于哺乳动物细胞以来已经扩大。研究人员正以前所未有的创新方式使用这一系统。Wang et al.， 2013，赵等人，2014年）．CRISPR/Cas9系统有几种变体，许多预先设计的含有这些变体的质粒可供购买。但是在老鼠身上使用这个系统最简单和最快的方法是什么呢?在接下来的几周，我们将有一篇文章更详细地介绍小鼠基因组编辑过程，但在这篇文章中，我们将概述一种选择引导RNA的简单方法，验证其功效在体外，并将其用于小鼠胚胎，以产生转基因小鼠系。希望这篇文章能帮助你在活的有机体内研究和运行尽快!
选择你的目标
CRISPR/Cas9通常被用于研究围绕特定基因的生物学(尽管它已经非常成功地用于筛选实验)。因此，如果你已经开始了CRISPR的道路，你可能已经有了一个你想要操纵的基因。现在是时候考虑你想在哪里攻击这个基因了。你是否应该在编码序列的开头切断它以删除整个基因?也许您对c端更感兴趣，并希望以该区域为目标。或者你甚至可能希望产生点突变，需要把注意力集中到那个特定的区域。无论你在哪里寻找，你可以自己扫描基因组寻找潜在的gRNA位点，或者你可以利用一些在线工具来为你做。一个这样的选择是CRISPR设计工具张实验室．这个简单的网站邀请你输入目标区域(大约500bp是最好的)并选择生物体。然后它会告诉你该区域可用的gRNA目标。的CRISPR软件媒人可以用来确定使用许多不同类型的gRNA设计软件的利弊。
当您对您的选择感到满意时，订购sgRNA是简单和容易的。有几家公司提供gRNA序列，如GenScript、ThermoFisher Scientific和OriGene，或者你可以通过你目前使用的任何一家DNA供应公司自行订购。你也可以找到很多之前验证过的Addgene的gRNAs．
在体外筛选最佳的gRNA
并不是所有的gRNA都有效。在我写这篇文章的时候，许多关于为什么gRNA的工作比其他的更好的细节仍然是未知的，但是不要担心!节省时间和精力的关键在活的有机体内工作就是筛选你的gRNA在体外第一。在体外筛选是一种简单而快速的方法来验证你所选择的gRNA，并且有一个额外的好处，那就是一旦你的编辑生成了，你就可以用引物来验证你的编辑。
开始在体外筛选过程中，你应该首先开发引物到你的gRNA周围大约500个碱基对序列。一旦放大，你就可以把这个区域插入pCAG-EGXXFP质粒用标准克隆技术(XX表示目标插入的位置，扰乱了EGFP荧光信号，关于这个质粒的详细信息，请参见Mashiko等人，2013年）．测试gRNA的功效很简单，只需将修饰过的pCAG-EGXXFP质粒以及PX330质粒(或表达gRNA的类似质粒)中的单个gRNA一起转染HEK293T细胞，每次一个gRNA。48小时孵育后，在荧光显微镜下评估细胞的荧光水平。荧光量越高，gRNA就越善于在目标位点上造成双链断裂，从而使EGFP的两半重组同源性定向修复，并导致EGFP的表达。使用这种技术，您可以同时评估几个sgRNA，并选择最有效的一个，以增加您的基因修改的机会在活的有机体内．
小鼠的CRISPR/Cas9基因编辑
既然你已经验证了你的gRNAs用于哺乳动物细胞，是时候将它们用于小鼠胚胎了。当研究人员第一次开始使用CRISPR/Cas9对小鼠进行基因组编辑时，他们通常会将gRNAs和编码Cas9的rna一起微注射到卵母细胞中。这种原始方法是在探索CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中的使用时开发的，它允许控制系统的每个单独组件。然而，直接注射验证试验(上)中使用的pX330质粒更容易，而且同样有效(Mashiko等人，2014年）．质粒比脆弱的RNA更坚固，因此核糖核酸酶污染导致降解的可能性更小，这可能会让你倒退几天。处理质粒DNA要容易得多，而且不需要处理RNA时需要的额外预防措施(例如，口罩，一个无尘和特别清洁的工作台)。
一旦幼崽出生
注射的小鼠胚胎发育大约需要19天。一旦他们出生，是时候为你想要的编辑筛选他们。好消息!还记得你设计用来生成pCAG-EGXXFP质粒的引物吗?它们是完美的引物，用于基因型您的小狗。一个简单的聚合酶链反应这些引物会让你知道是否有重大缺失，PCR产物的测序会给出具体细节，说明到底插入了什么或删除了什么。
每个实验室将使用稍微不同的方法来基因型他们的小狗。取一只脚趾，一根手指，一个尾巴尖，或这些的组合，可以让你确定哪只幼犬是哪只，一旦测序回来。另外,如果你可以等,你可以推迟,直到幼崽pcr是2 - 4周大,使用耳标方法(创建不同的模式的耳洞和使用材料的基因),但记住,这种方法要求你可能没有突变的家鼠,花费的钱和空间。作为一个规则，筛选你所有的小狗，除非你有一个巨大的窝(超过15只小狗)。在这种情况下，你应该能够找到你的突变体从筛选最少8-10只小狗。你们在验证试验中看到的荧光水平应该能准确地指示有多少幼鼠会携带突变许多携带突变的小鼠在每个细胞中都是纯合子的;然而，如果微注射是在原核融合时进行的，你可能会有几只花叶鼠。为了弄清楚这些老鼠体内有什么等位基因，你可以把PCR产物克隆成pBluescript克隆载体并对得到的质粒进行测序。
从你决定在老鼠身上做基因改造实验到你拥有F0一代(除了生活中的小意外和事情)大约需要3个月的时间。这是一个巨大的进步，以前的鼠标工作可能需要8个月或更长时间。随着可以用于研究各种现象的小鼠品系的快速繁殖，在不久的将来，我们可能会从我们最喜欢的哺乳动物模型生物身上学到更多东西。
非常感谢我们的客座博主萨曼莎·杨。
萨曼莎·杨(Samantha Young)是一名医学作家，拥有生殖生物学和遗传学博士学位。她喜欢交流最新和最伟大的科学内容。
参考文献
1.赵承宇等。CRISPR/ cas来源的rna引导内切酶和nickase的脱靶效应分析基因组研究24.1(2014): 132 - 141。PubMedPMID: 24253446．公共医学中心PMCID:PMC3875854．
2.Mashiko, Daisuke等。表达Cas9的圆形质粒和单导向RNA的原核注射产生突变小鼠科学报告3(2013)。PubMedPMID:24284873．公共医学中心PMCID:PMC3842082．
3.Mashiko, Daisuke等。“将CRISPR/Cas质粒注入受精卵进行大规模小鼠突变的可行性”发展、成长和分化56.1(2014): 122 - 129。PubMedPMID: 24372541．
4.王浩毅，等。“通过CRISPR/ cas介导的基因组工程，一步生成携带多基因突变的小鼠。”细胞153.4(2013): 910 - 918。PubMedPMID: 23643243．公共医学中心PMCID:PMC3969854．
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