酵母双杂交筛选的提示

两种混合系统在酿酒酵母在1989年被广泛用于筛选细胞中的分子相互作用，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质- dna和蛋白质- rna相互作用。

20世纪80年代，在这个领域出现了一系列的发现真核生物的转录激活和细胞生物学。在此期间，蛋白被成功地表达为融合蛋白，保留了它们各自的活动(1）.研究人员还发现了一些转录激活因子的模块化格式:DNA结合域(DBD)和转录激活域(TA)在分离时保持各自的活动(2)，不同系统的DBD和TAs可以有效组合(3.）.例如，在图1中显示的融合蛋白的DBD仍然能够与其靶基因的上游激活序列(UAS)结合，在本例中是一个报告基因(例如。荧光素酶或绿色荧光蛋白)，无论它是否与转录激活因子(1a)或抑制因子(1b)相互作用。科学家们利用这些发现创建了一个筛选蛋白质相互作用的新系统。在后来的几年里，酵母转化协议的改进也帮助建立了酵母双杂交(Y2H)系统，作为一个强大和流行的实验室工具。

在经典的双杂交系统(也称为相互作用陷阱)中，基因编码感兴趣的蛋白质
(POI)融合到TAs和dbd(见图2a) (4）.然后，这些融合在酵母株中共同表达，该酵母株还包含一个报告基因，该报告基因克隆在包含DBD目标序列的启动子下游。DBD-POI融合(通常被称为“诱饵”,图2 b)不能激活报告基因表达自己,但是,如果两个POI的相互作用,这将使POI-TA融合(通常称为“猎物”)在近距离接近报告基因启动子的激活表达(图2)。然后报告基因就可以检测到那些在感兴趣的蛋白质之间发生结合的细胞。

虽然原来的Y2H系统使用酵母Gal4激活剂，细菌LexA DBD和lacZ报告基因(3.，4)，现在有许多变体，包括许多使用营养缺陷挽救基因作为报告基因，还有一些抑制而不是激活转录。HIS3报告系统(例如gateway兼容诱饵Y2H质粒)pEZY202从yu zhu张的实验室)是前者的一个例子。在这个系统中，组氨酸营养缺陷宿主菌株被用来选择HIS3基因的结合依赖表达，这是组氨酸生产和在HIS3缺陷培养基上生长所必需的。甚至有可能Y2H系统完全避免转录报告;在分裂-荧光素酶系统中，只有当荧光素酶的两个半部分的融合相互作用并使染色质剪接启用时，染色质介导的剪接才能重组功能性荧光素酶(5）.

酵母双杂交系统筛选

虽然最初的研究使用单一诱饵和猎物蛋白融合来证明Y2H系统的实用性，但在基于Y2H的筛选中，更常见的是使用多个猎物和单一诱饵。通过这种方式，与感兴趣的分子(“诱饵”)相互作用的蛋白质可以被“钓出来”以供进一步研究。

在Y2H筛选中，一组猎物融合可以使用来自相关生物体的随机基因组片段，或定义的cDNA文库(例如，特定细胞类型的整个蛋白质组，或基于细胞间隔或生长阶段的子集)生成。猎物库可以应用于单个群体的诱饵(例如，转化两个融合质粒，或将两个单倍体酵母融合质粒转化子配对成二倍体菌株进行筛选)，或排列在96孔板上，每个孔中包含一个确定的猎物融合。前者可以筛选更多的猎物，而后者则省去了筛选后识别猎物蛋白质的步骤。

也可以同时筛选诱饵和猎物的文库，以便尝试同时获取一组蛋白质的整个相互作用。然而，由于Y2H筛查容易出现假阳性和假阴性，这些实验的设置、进行和分析必须谨慎，以获得可靠的信息。

尽管双杂交系统是筛选分子相互作用的有力工具，但在进行这些实验时，准确性和重现性是常见的问题。即使在小规模实验中也可能出现假阳性，尽管这些通常可以通过使用适当的重复和控制(见提示)，并通过其他方法验证线索。更常见的是假阴性;多达75%的已知交互作用可能被单次双杂交筛选错过(6)。更多关于如何在筛选时提高交互率的信息，请参阅提示部分!

双杂交筛选技巧

减少假阳性:

• 重复这个实验以减少报告基因不加区分的激活的可能性。包括仅限猎物的控制也提供了报告器激活的基线水平。
• 改变诱饵和猎物蛋白质的表达水平——过度表达可能导致错误的相互作用。降低表达式级别将增加绑定的严格程度。
• 最重要的是:使用其他技术独立验证已确定的绑定伙伴!

减少假阴性:

导致可检测报告信号的相互作用取决于许多因素，包括蛋白质表达和正确折叠、翻译后修饰、蛋白质降解、真核筛选中进入细胞核和融合配置。这些参数中的一个或多个出现问题的可能性会导致Y2H筛检中出现大量假阴性。

• 用一对已知结合的蛋白质测试报告系统可以作为良好的阳性对照，以确保设置工作正常。你最不想做的事情就是运行你可爱的库屏幕，却发现系统本身不工作，因为你的报告蛋白在酵母中不起作用!
• 许多假阴性源于或因异体系统中靶蛋白的表达而加重(如哺乳动物蛋白)酿酒酵母)。

• 虽然这可能很难解决广泛的猎物蛋白质，现在有一些双杂交系统，在模式生物，包括细菌，替代真菌(白念珠菌，pC2HB） (7)和哺乳动物细胞。
• 如果问题是你的蛋白质不是翻译后修饰的，在实验宿主菌株中负责修饰的酶的共表达可以帮助。

• 为了减少融合蛋白的配置在物理上阻断蛋白质伴侣或UAS/报告基因的结合位点的机会，可以使用这些蛋白的N端和c端融合来筛选相同的诱饵和猎物库。通过这种方式，你的蛋白质的两端都被筛选以确定是否结合。
• 使用多种表达水平和系统可以缓解因目标蛋白表达低或错误而产生的假阴性。事实上，减少假阴性和产生更有力的筛选的一个良好的总体策略是使用多种不同的诱饵和猎物载体。这已被证明与使用五种独立的蛋白质相互作用检测方法(6）.
• 在真核细胞中，为了结合DNA并激活报告基因，融合蛋白必须进入细胞核。为了规避跨膜蛋白的这一需求，人们设计了一种分裂泛素系统(8）.

参考文献

1.Casadaban M.J．，Martinez-Arias一．，Shapira S.K．，周J．β -半乳糖苷酶基因融合分析大肠杆菌和酵母中的基因表达。Enzymol方法。1983; 100:293 - 308。PubMedPMID: 6312261．

2.DNA结合与真核调控蛋白转录激活功能的分离。科学。1986;231:699 - 704。PubMedPMID: 3080805．

3.具有原核抑制因子DNA特异性的真核生物转录激活子。细胞。1985;43:729 - 736。PubMedPMID: 3907859．

4.王志强，王志强，王志强，等。一种新型的蛋白质相互作用基因检测系统。大自然。1989;340:245 - 246。PubMedPMID: 2547163．

5.小泽，T.，海原，A.，佐藤，M.，田原，K.，梅泽，Y.l.基于蛋白质剪接的Split荧光素酶作为检测哺乳动物细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的光学探针。肛门化学2001;73:2516 - 2521。PubmedPMID: 11403293．

6.陈,Y.CRajagopala S.V．，Stellberger T．，会继续光顾P．酵母菌双杂交系统的穷举基准分析。自然方法。2010;7:667 - 668。PubmedPMID: 20805792．

7.关键词:白色念珠菌，CUG密码子，双杂交系统核酸学报2010;38(19):e184。PubmedPMID: 20719741．公共医学中心PMCID: PMC2965261．

8.Obrdlik, P.， El-Bakkoury, M.， Hamacher, T.， Cappellaro, C.， Vilarino, C.， Fleischer, C.， Ellerbrok, H.， Kamuzinzi, R.， Ledent, V.， Blaudez, D.， Sanders, D.， Revuelta, j.l.， Boles, E.， André， D.， and Frommer, W.B.K+通道相互作用检测遗传系统优化的系统研究膜蛋白相互作用．美国国立科学院学报2004;101(33): 12242 - 12247。PubmedPMID: 15299147．公共医学中心PMCID: PMC514463．

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