本文由威斯生物工程研究所的客座博主Alissa Lance-Byrne和Alex Chavez贡献。
CRISPR / CAS9.技术已经彻底改变了分子生物学和生物工程领域，因为它促进了一种简单和可扩展的方法的发展，进行有针对性的基因编辑。Cas9是一种DNA结合蛋白，当与适当设计的小RNA或引导RNA (gRNA)复合时，它几乎可以指向任何遗传位点。传统上，gRNA包含一个20个核苷酸的序列，与基因组中的目标位点或原间隔位互补。原生Cas9有两个催化结构域，每个催化结构域在与原间隔体结合时切割一条DNA链。由此产生的双链断裂(DSB)刺激DNA修复机制，可以利用该机制使基因失活或引入所需的遗传改变。
传统的CAS9监管机构
除了其实用性对DNA进行有针对性的修饰，CAS9还可以重新编程以用作基因表达的调节剂。其催化结构域可以突变以使蛋白质的核灭绝能力失活，并且该核酸酶 - 零或“死”Cas9（DCAS9）变体可以融合至效应域，例如转录激活者或压缩机．这些融合蛋白保留了识别DNA并与DNA结合的能力;当与agRNA将它们引导到感兴趣基因的启动子，他们已被证明可以显着改变表达水平。
Cas9既可作为修饰DNA的手段，又可作为调节基因表达的手段，这使它成为研究基因功能的宝贵工具。然而，系统依赖于两种不同的Cas9变体(核酸酶活性或无核酸酶)来产生不同的干扰是有局限性的。例如，考虑尝试同时和选择性地诱导单个细胞内不同基因位点的剪切和表达调控的挑战。人们可以想象将Cas9的核酸酶阳性和核酸酶阴性变种以及必需的gRNA一起转染细胞，但不可能控制哪一种gRNA与哪一种Cas9变体结合。为了解决这个问题，以前的研究提出了同时使用“正交”Cas9蛋白质每一种都与不同的gRNA相互作用，允许用户决定哪个Cas9蛋白指向哪个靶点(1)．尽管这是可能的，但这种策略存在一些局限性。也许最重要的是，大多数Cas9同源物的特征不如传统使用的SpCas9(源自细菌)酿脓链球菌)．因此，对靶向转录和表观遗传调节的遗传工具减少了这些蛋白质。此外，在已经仔细审查的那些Cas9 orthologs中，大多数已经显示出比SPCAS9更有限的活性（2)．在许多情况下，这是由于较低的相对核酸效率以及更严格的靶向规则，导致可用目标站点的减少。
用截短的GRNA调节基因表达
另一种方法是通过改变其复合而不是蛋白质本身来调节Cas9的核酸酶活性。当天然CAS9与已经截断的GRNA复合时，使得它表现出15或更少对靶位点的互补性的核苷酸，CAS9的DNA结合能力在消除其核酸核分动活性时保持完整（图1）（1那3.)．通过掺入RNA发夹（例如MS2发夹），可以进一步修饰GRNA，其能够募集额外的效应域（4.)．综上所述，这些微小的gRNA改变可以被利用来快速廉价地生成一个有效的基于Cas9的转录调控因子，而不对Cas9进行任何功能改变。例如，当原生(核酸酶活性)Cas9与一个≤15nt的gRNA相互作用时，该gRNA包含一个能够招募转录激活剂的RNA适配器，在没有基因组编辑的情况下观察到基因表达的强大调控(图2和3)(5.那3.)．
截断的grna的好处
重要的是，截短引导的使用已经在很大程度上被证明会导致错配耐受性的降低，从而增加相对于更常用的20nt grna的特异性。然而，值得注意的是，在极少数情况下，已发现截短的gRNAs(≤15nt)保留了一些诱导Cas9进行编辑的能力(AC、WLC和JQ，未发表的结果)。使用截短引导基因的另一个好处是，它们可以被输送到已经表达核酸酶活性Cas9的系统中，避免了产生新的细胞系或转基因动物表达dCas9作为调节基因表达的手段(6.)．
改变靶向不同感兴趣部位的GRNA的长度因此代表了在CAS9核酸酶活性上施加紧密控制的直接手段，同时消除了对正交CAS9种类的依赖性。在单个电池内，靶向一组遗传基因座的全长导向器可以与靶向不同的基因座的截短的GRNA一起引入，以诱导同时切割和转录激活或在各个部位的抑制。
非常感谢我们的嘉宾博主Alissa Lance-Byrne和Alex Chavez!
Alissa Lance-Byrne是加州大学圣克鲁斯大学的研究生，她的研究专注于工程纳米粒子作为药物递送系统。她也是美国宇航局研究火星模拟环境中的生物环化保存。
Alejandro（Alex）Chavez是Addgene Scientific咨询委员会的成员。他在哥伦比亚大学的实验室专注于通过创建创新技术来推进科学发现。迄今为止，他的小组已经开发了几种流行的基于CRISPR的工具，用于改变DNA序列或调节基因表达。
参考文献
1. esvelt，凯文M.等人。“正交Cas9蛋白，用于RNA引导基因调节和编辑。”自然方法10.11(2013): 1116 - 1121。PubMed.PMID: 24076762．pmed中央PMCID：PMC3844869．
2。Chari，Raj等人。“通过图书馆对图书馆方法解开CRISPR-CAS9基因组工程参数。”自然方法12.9(2015): 823 - 826。PubMed.PMID：26167643．
3.Kiani，Samira，等。“Cas9 Grna工程，用于基因组编辑，激活和抑制。”自然方法12.11(2015): 1051 - 1054。PubMed.PMID：26344044．pmed中央PMCID：PMC4666719.．
4.Mali, Prashant等。“通过Cas9进行rna引导的人类基因组工程。”科学339.6121（2013）：823-826。PubMed.PMID：23287722．pmed中央PMCID：PMC3712628．
5。Dahlman，James E.等人。“用催化活性Cas9核酸酶的正交基因敲除和激活。”自然生物技术（2015）。PubMed.PMID: 26436575．pmed中央PMCID：PMC4747789．
6。普拉特，兰德尔J等。“CRISPR-Cas9敲入小鼠用于基因组编辑和癌症建模。”细胞159.2(2014): 440 - 455。PubMed.PMID：25263330.．pmed中央PMCID：PMC4265475．
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