金宝搏app下载荧光蛋白101:光活化荧光蛋白

金宝搏app下载（FPs）为科学家提供了一种简单而有效的方法来标记细胞蛋白质，并研究蛋白质定位、相互作用和表达。然而，FP蛋白质融合（FP嵌合体）的一个警告FP嵌合体在细胞内不断合成和降解，因此在任何给定时间，FP嵌合体蛋白质可能处于许多合成和降解阶段中的任何一个。因此，使用标准FP几乎不可能确定特定的蛋白质转换或暂时表达-嵌合蛋白。

光活化荧光蛋白(PA-FPs)是一金宝搏app下载种荧光蛋白，当暴露在特定波长的光下时，其光谱特性会发生独特的变化。PA-FPs可以从低荧光状态激活到高荧光状态，它们可以从一种荧光颜色转换到另一种荧光颜色，或者它们的荧光可以被可逆地打开和关闭。这种调节荧光的能力使科学家能够观察到单个荧光分子，否则传统的FP成像就会忽略这些分子。PA-FPs分为2个主要类别-那些与不可逆转的和可逆的光活化——并使复杂的成像技术成为可能。

不可逆光敏化

不可逆的PA-FPs可以通过暴露在特定波长的光下，从昏暗或无荧光状态切换到更亮的荧光状态。开关或光转换通常需要不到一秒钟。第一个成功的不可逆PA-FP是PA-GFP。PA-GFP来源于水母(Aequorea victoria)的GFP (wtGFP)，是通过将苏氨酸203突变为组氨酸(T203H) (1.）.wtGFP通常包含中性(质子化)和阴离子(去质子化)形式的发色团的混合布居数，这有助于wtGFP的激发光谱的两个峰-主要的397 nm峰和次要的475 nm峰。当紫外-紫外光(~400 nm)照射wtGFP时，发光体主要转变为阴离子形式，在488nm蓝光激发下荧光增强。PA-GFP的T203H突变产生了一个中性的发色团群体，使PA-GFP在488nm光照射下几乎不显示荧光。然而，当紫外光先出现时，它会导致发色团从中性到阴离子形式的不可逆光转换，这使得PA-GFP在蓝光照射下的荧光增加了100倍(1)。

与PA-GFP类似，科学家后来通过对增强型RFP变体进行几轮随机诱变筛选，开发出红色荧光PA FPs。PA mCherry（E26V/A58T/K69N/L84F/N99K/S148L/I165V/Q167P/L169V/I203R）(2.)和PA-mRFP1（S146H/I161V/I197H）(3.)分别来自DsRed和mRFP。当用紫光照射时，这两种变体都被光转化为发出更亮红色荧光的形式。由于绿光发射对细胞的光毒性更大，大多数研究活体成像模型的科学家更喜欢pa - rfp而不是PA-GFP。

另一类不可逆PA-FPs是photoconvertible金宝搏app下载荧光蛋白（PC-FPs）。PC-FPs可以从一种荧光颜色转换为另一种荧光颜色（例如绿色到红色，或青色到绿色）。

例如，mEosFP(以希腊神话中的黎明女神命名)从绿色荧光转变为红色荧光。mEosFP暴露在紫外光下会在发色团附近产生不可逆的分裂，从而发出红色荧光(4.)。EosFP的二聚体或串联二聚体版本优于单体版本，因为mEosFP发色团的形成需要低于30°C的温度，这对于哺乳动物细胞的实验并不理想。

Dendra2是另一种单体PA-FP，与mEosFP不同，它可以在更舒适的37°C下形成发色团(5.）.当暴露在蓝光下时，Dendra2能从绿色荧光转变为红色荧光，这比其他PA-FPs使用的紫外光对活体组织的光毒性更小。还发现了其他几个不可逆的PA-FP光谱变体，如Kaede和PS-CFP2(见表1)。

表1:所选不可逆光活化荧光蛋白的性质金宝搏app下载

可逆光敏化

相对于不可逆的PA-FPs，可逆的PA-FPs(也称为光开关)可以从暗状态切换到亮荧光状态(“点燃”)，从亮状态切换到暗无荧光状态(“猝灭”)。通过激活两种不同波长的光，光敏开关可以发生多次(见表2)。

最著名的可逆pa - fp是自然产生的Dronpa蛋白(以dron命名，一个忍者术语，意为消失，pa意为光激活)(6.）.龙柏被蓝色波长的光激活，导致绿色荧光的发射，但进一步暴露在蓝光下也会使发色团失活，导致非荧光状态。暴露在紫外线下，龙柏可以被可逆地重新激活。蓝光同时激活和抑制Dronpa的事实并不理想，因为这意味着Dronpa会迅速失活，释放的光子更少，导致荧光更暗淡。事实上，许多早期的可逆PA-FPs也显示这种“负”光开关。

2008年，科学家利用诱变筛选找到了一种不会那么快失活的龙柏。Padron是一个单体，可逆PA-FP衍生自Dronpa (T59M / V60A / N94I / P141L / G155S / V157G / M159Y / F190S) (7.)Padron的“积极”转换行为与Dronpa相反；当暴露在蓝光下时，Padron从暗状态光转换为激活状态，发出明亮的绿色荧光。当暴露于紫外光时，Padron被灭活。

红樱桃(8.)是另一类可逆PA-FPs。这些被设计成第一个可逆的，单体红色荧光PA-FPs。r樱桃具有高的背景荧光，但它们的单分子亮度和从暗状态切换到红色荧光状态的能力使它们在绿色PA-FPs的双色成像中非常有用。

表2:选择性可逆光活化荧光蛋白的性质金宝搏app下载

为你的实验选择一种光激活荧光蛋白

与使用标准FPs进行实验类似，在为实验选择PA-FP之前，有几个参数需要考虑，例如亮度,耐光性，pH稳定性，37°C下生色团成熟率，转换率和背景荧光水平。对于任何PA-FP应用，荧光越亮越好。荧光越多通常意味着发射的光子越多，更容易在背景上方捕获清晰图像。

大多数PA-FPs有两种形式:单体和四聚体。四聚PA-FPS更适合于全细胞成像和研究细胞器运输。单体PA-FPs通常用于研究单个蛋白质的特性，因为单体状态对内源性蛋白质结构和功能的干扰较小。通过产生单体PA-FPs，嵌合蛋白的可能性更小oligomerize，破坏细胞功能和定位，或导致蛋白质聚集。

另一个需要考虑的重要参数是光照激活前后PA-FP亮度的对比度。高对比度通常表明PA-FP在没有光活化的情况下具有低水平的自发荧光，导致信噪比增加。为您提供易于解释的实验结果。

用来激活PA-FP的光强度也应该考虑。如果激活所需的光强度太高，那么在实验开始之前，光激活步骤就会伤害你的细胞!如果你在表演多色实验，你要确定用来激活第一个PA-FP的光不会漂白第二个PA-FP，反之亦然。最后，由于每个显微镜都有它自己的怪癖(变焦水平，强度，可能的激励激光)，也很重要的是优化您的激活协议，为您的特定设置。

光活化荧光蛋白的应用金宝搏app下载

PA-FPs的一些最重要的应用包括增强蛋白质、细胞器和细胞的光学活体成像。与FPs类似，PA-FPs允许无创标记，但相比之下，PA-FPs通过持续激发，降低了标准FPs可能引发的光漂白和光毒性。通过生成PA-FPs融合到细胞内的蛋白质，科学家可以跟踪单个蛋白质的定位、周转和运输，以及细胞器的运输和动力学(裂变、融合等)。例如，通过工程将PA-GFP标记到线粒体基质蛋白(mito-PAGFP)Youle实验室能够可视化和量化健康和凋亡细胞中线粒体的融合动力学(9）.

PA-FPs已经帮助革新了超分辨率显微镜领域。PA-FPs，尤其是单体可逆型的PA-FPs，非常适合于超分辨率成像，因为该技术的功率很大程度上依赖于同一荧光团多次成像来重建图像。用于超分辨率成像的最佳PA-FPs通常具有以下特征:高对比度、明亮的荧光、低自发激活和两个荧光波长之间的光开关。

事实上，在超分辨率显微镜领域，PA FPs已经帮助创造了几种新的成像方法，包括光激活定位显微镜（PALM，也称FPALM）(11）.对于PALM，一小块含有非活性PA-FPs的区域被光活化，成像，然后光漂白。然后以同样的方式激活其他PA-FP分子，直到足够多的分子被分析来构建图像，从而提供细胞中详细的蛋白质定位信息。需要记住的一点是，尽管PA-FPs在超分辨率成像方面比传统FPs有了很大的改进，但它们仍然不能发射出可切换染料所能实现的大量光子。

相关光镜和电子显微镜（CLEM）是一种结合电子显微镜（EM）和荧光定位数据的成像技术。然而，该技术需要苛刻的固定条件来保存细胞结构（0.5-1%四氧化锇）。这些条件破坏了大多数PA FPs，但在2015年Looger实验室设计了两种能够承受这些条件的EosFP变体-mEos4a和mEos4b(12）.这两种变体都比mEos2 (mEos4b是完全单体)更具单体性，并且显示出明亮且耐光的绿色和红色状态。

除了这些成像应用之外，PA-FPs还被开发用于酵母作为…的一部分biosenors，等等。你最喜欢PA-FPs的用途吗?请在下面的评论区告诉我们!

目前，有超过20种不同的PA-FPs可供科学界使用，新的变体仍在设计中。通过将PA-FPS与超分辨率显微镜相结合，科学家们现在有了工具，可以用非凡的分子细节来探测细胞动力学和功能。

参考文献

1.帕特森，乔治H和詹妮弗利平科特-施瓦茨。一种可光激活的绿色荧光蛋白，可选择性地对蛋白质和细胞进行光标记。科学通报(2002):1873-1877。PubMedPMID: 12228718．

2.等。“用于高分辨率双色荧光显微镜的光激活mCherry。”自然方法6.2(2009):153-159。PubMedPMID: 19169259公共医疗中心PMCID: PMC2901231．

3.Verkhusha、Vladislav V.和Alexander Sorkin。“将单体红色荧光蛋白转化为光激活探针”，《化学与生物学》12.3（2005）：279-285。PubMedPMID: 15797211．

4.Wiedenmann, Jörg，等。EosFP是一种荧光标记蛋白，具有紫外光诱导的绿到红荧光转换。美国国家科学院院刊101.45(2004):15905-15910。PubMedPMID: 15505211．PubMedPMCID: PMC528746．

5.Gurskaya，Nadya G.等人，《蓝光诱导的单体绿色到红色光激活荧光蛋白的工程》，《自然生物技术》24.4（2006）：461-465。PubMedPMID: 16550175．

6.安藤，亮子，水野秀明，宫崎骏。可逆性蛋白高亮显示调控的核浆快速穿梭科学306.5700(2004):1370-1373。PubMedPMID:15550670．

7.Andresen，Martin等人，“光开关荧光蛋白能够实现单色多标记成像和双色荧光金宝搏app下载纳米拷贝”，《自然生物技术》26.9（2008）：1035-1040。PubMedPMID: 18724362．

8.等。“用于远场荧光纳米显微镜的单体可逆切换红色荧光蛋白的生成”。金宝搏app下载生物物理学报95.6(2008):2989-2997。PubMedPMID: 18658221公共医疗中心PMCID: PMC2527278．

9.Karbowski, Mariusz等。“通过单个细胞器的光标记对线粒体动力学进行定量研究表明，在凋亡的Bax激活阶段，线粒体融合被阻断。”J Cell Biol 164.4(2004): 493-499。PubMedPMID: 14769861公共医疗中心PMCID: PMC2172000．

10.Vorvis, Christina, Steven M. Markus和Wei‐Lih Lee。“用于芽殖酵母中蛋白质追踪研究的光激活GFP标记盒”酵母25.9(2008):651-659。PubMedPMID: 18727145公共医疗中心PMCID:PMC4007248．

11.赫斯、塞缪尔·T、塔努·基里拉扬和迈克尔·D·梅森。“荧光光激活定位显微镜超高分辨率成像”，《生物物理杂志》91.11（2006）：4258-4272。PubMedPMID: 16980368公共医疗中心PMCID: PMC1635685．

12.Paez-Segala, Maria G.等。clm耐固定光活化荧光蛋白。金宝搏app下载自然方法12.3(2015):215-218。PubMedPMID:25581799公共医疗中心PMCID: PMC4344411．

13.Berlin，Shai，et al.“用于靶向神经元成像的光激活基因编码钙指示剂”，《自然方法》12.9（2015）：852-858。PubMedPMID: 26167640公共医疗中心PMCID: PMC4597790．

14.王英晓，John Y-J。害羞，还有舒剑。荧光蛋白、活细胞成像和机械生物学:眼见为实。为基础。启生物医学。工程10(2008):1-38。PubMedPMID: 18647110．

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