为了对环境条件做出反应，细胞必须能够检测到细胞外刺激。其中一种方法是通过G蛋白偶联受体（GPCR），该受体在包括嗅觉、味觉、视觉、炎症和神经传递在内的信号传递过程中发挥多种作用。但是，由于大约950种不同的编码GPCR的人类基因（Takeda S等人，2002年）和许多下游复合体参与其中，科学家很难理解GPCR激活如何导致下游效应。
布莱恩·罗斯实验室创造了一个质粒集合特鲁帕斯询问16个非视觉G蛋白信号转导器(统称为转导器组)中的14个，这些转导器可以在GPCRs下游被激活，而不涉及视觉(Olsen RHJ et al.， 2020)。换能器复合物由三个亚基的三聚体组成:α、β和γ (Gα、Gβ和Gγ)，统称为异质三聚体G蛋白。这种复合物将细胞表面的GPCR接收到的信号转化为行动，从而引发大量信号级联反应，诱导不同的细胞反应。这种工具的最大优点之一是能够识别特定的传感器复合物，这些复合物在与感兴趣的GPCR配体结合时被激活。
TRUPATH是如何工作的？
TRUPATH集合允许研究人员测量不同的Gα、Gβ和Gγ亚基组合的物理关联。当不活跃时，这些亚基在结合到GPCR细胞内表面的三聚体复合物中被发现。配体结合到GPCR的细胞外表面引起GPCR构象的变化，导致Gα亚基的激活。激活的Gα交换使GDP与GTP结合，导致Gα亚基从Gβγ二聚体解离，激活下游信号通路。
这种离解可以用一种叫做B光致发光ResonanceE能量Transfer (BRET)。BRET类似于F差劲的ResonanceE能量Transfer(烦恼)，其中供体荧光团被用来激发受体荧光团。BRET的不同之处在于能量转移发生在发光供体和荧光受体之间。TRUPATH使用BRET的更新版本，称为BRET2。
图1:TRUPATH通过生物发光共振能量转移2 (BRET2)测量异质三聚体G蛋白解离。随着药物的结合，α和β亚基分离导致BRET2信号降低。随着药物浓度的增加，BRET2信号减弱。 |
TRUPATH BRET2生物传感器系统是通过构建14个荧光素酶供体Rluc8-Gα嵌合体、4个受体GFP2-Gγ嵌合体和两个未标记的Gβ结构而开发的。对于Gγ结构，GFP2标签与蛋白质的N-末端融合。对于Gα结构，Rluc8的定位更具挑战性。Roth实验室利用结构导向蛋白质工程和实验优化来确定Rluc8插入在Gα内的最佳定位。尽管进行了详尽的细化，但无法为16个非视觉G蛋白传感器中的两个产生最佳的Rluc8-Gα结构。
为了使用TRUPATH系统，用表达所需GPCR的质粒、Gα-Rluc8质粒以及合适的Gγ-GFP2和Gβ结构物转染细胞。然后用发光酶底物柯伦他嗪处理细胞，然后添加内源性配体或药物。在非活性状态下，发光嵌合蛋白Gα-Rluc8和Gγ-GFP2将紧密结合，导致高水平的GFP2发射。在配体激活后，复合物将分离，导致GFP2发射减少。激活状态可通过BRET2比率测量，即GFP2发射与RLuc8发射的比率（见图）。
truth可以用来做什么?
罗斯实验室在许多不同的实验方法中使用了TRUPATH质粒。他们首先评估了已研究和未研究的GPCR对不同激动剂的不同转导体成员的激活情况。这些研究表明，不同G蛋白传感器的GPCR混杂，对于特定的受体-配体对，其效力和效力在整个转导体中通常是不一致的。他们进一步使用TRUPATH在单个GPCR上分析传感器组中的一组化合物，显示了使用TRUPATH作为筛选技术的有效性。最后，可以使用TRUPATH系统测量拮抗剂和反向激动剂的活性。
结论
虽然GPCRs通路的重要性已经为人所知，并因此成为许多药物的靶点，但对于GPCRs是如何通过G蛋白信号转导传递信号的，仍然只有部分的了解。TRUPATH集合为科学家提供了一个工具箱，以了解不同GPCRs的转导组信号。该集合可用于研究内源性配体及其激活途径，以及药物的激活，以进一步了解其作用机制。这些质粒可用作收集，有利于跨转导体的筛选，从而对GPCR介导的应答有更全面的了解。
致谢
特别感谢Roth实验室的研究生Jeff DiBerto编辑了这篇博客文章。
工具书类
Olsen RHJ、DiBerto JF、English JG、Glaudin AM、Krumm BE、Slocum ST、Che T、Gavin AC、McCorvy JD、Roth BL、Strachan RT（2020）TRUPATH，一个用于询问GPCR传感器组的开源生物传感器平台。《自然化学生物学》16:841–849。https://doi.org/10.1038/s41589-020-0535-8
Takeda S，Kadowaki S，Haga T，Takaesu H，Mitaku S（2002）从人类基因组序列鉴定G蛋白偶联受体基因。FEBS信函520:97–101。https://doi.org/10.1016/s0014-5793(02)02775-8
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