本文由威斯康辛州麦迪逊市莫格里奇研究所博士后Natalie Niemi撰写。
通常认为，大约三分之一的细胞蛋白质是通过磷酸化修饰的(1.)．然而，一系列模型系统中蛋白质磷酸化研究的扩展，加上质谱技术的进步，表明磷酸化远比以前认识到的更为普遍。PhosphoSitePlus，是翻译后修饰最全面的数据库之一，在高等哺乳动物的蛋白质组中鉴定了惊人的约25万个磷酸化事件(2.)．我们如何开始理解这些磷酸化事件对给定蛋白质活动的重要性?
研究蛋白质磷酸化的经典方法
为此有许多经典方法，其中最常见的是利用拟磷残基。感兴趣的磷酸化残基突变为带负电荷的残基，天冬氨酸或谷氨酸，赋予与磷酸化相关的负电荷。然而，这些氨基酸不能再现磷酰化修饰的真正空间和电荷性质；它们都小得多，只带一个负电荷，而不是磷酸基团中的双负电荷。此外，这些突变是不可逆的，因此不能在其适当的调控范围内反映蛋白质修饰的真实状态。
为了避免这些问题，也有可能分离蛋白的磷酸化中间体进行表征。然而，磷蛋白通常是低丰度的，因此很难纯化到研究所需的数量。此外，分离纯化磷酸化产物的能力通常依赖于磷酸化特异性抗体等工具，而这些工具对于大多数已记录的磷酸化位点都是不可用的。如果已知一个候选的调节激酶，就有可能产生非磷酸化的重组蛋白并执行在体外激酶反应。然而，研究人员往往缺乏对调节激酶的了解，无法获得活性激酶进行反应，或在激酶特异性方面遇到困难在体外．通过位点特异性结合磷酸化丝氨酸(如下所述)，纯化重组蛋白体系的建立为研究人员了解磷酸化对酶功能的贡献提供了有价值的工具。
磷酸丝氨酸掺入的发展
对原核生物谱系的广泛基因组测序显示，在产甲烷古菌的一个子集中有一个奇怪的异常:这些生物缺乏典型的半胱氨酸tRNA合成酶，尽管在它们的蛋白质组中有大量的半胱氨酸(3.)这导致最终发现了一种天然存在的磷酸丝氨酸tRNA合成酶，它是半胱氨酸tRNA形成途径上的中间产物(4.)磷酸丝氨酸（Sep）-tRNA合成酶的发现使研究人员能够创建一个正交翻译系统（OTS），将磷酸丝氨酸直接并入重组蛋白质中(5.)．该系统的优化定义了翻译所需的三个组件(图1):
- 识别特定“开放”密码子并利用该三联体结合磷酸丝氨酸的tRNA
- 一种Sep-tRNA合成酶，用磷酸丝氨酸给tRNA充电
- 一种特殊的延伸因子，允许pser结合的多肽进行适当的延伸和翻译。
这三种成分被证明能有效地将磷酸丝氨酸结合到重组蛋白中，如激酶MEK1(5.)．MEK1在其激活环上没有必要的双磷酸化事件时是不活跃的，但可以通过这些残基的拟磷突变使其构成活性。由于前面提到的局限性，激活环上的拟磷突变不能完全激活MEK1。事实上，在上述研究中，仅仅用磷酸丝氨酸替换其中一个MEK1拟磷残基(创建pSer/拟磷双突变体)，激酶活性就比双拟磷双突变体提高了70倍以上。这强调了……的优点善意的pser加入重组蛋白作为拟磷突变的替代。
创建磷酸丝氨酸结合蛋白
pser结合蛋白的生成需要一个包含OTS的分子工具包，一个用于蛋白质生产的合适的细菌宿主菌株，以及一个编码感兴趣的开放阅读框(ORF)的表达质粒(图2)。
1.磷酸丝氨酸OTS
phosphoserine OTS的主干Sep-OTS含有在单个质粒上翻译pser结合蛋白所需的成分。这包括一个tRNA的4个拷贝，可以特异性识别琥珀终止密码子(TGA)来编码磷酸化丝氨酸、Sep-tRNA合成酶和EF-Sep -一个优化的延伸因子，在翻译过程中接受sep带电的tRNA。通过Addgene可以获得许多“口味”的Sep-OTS质粒，但我们对它们进行了最广泛的研究和优化Sep-OTSλ并可推荐使用(6.)．
2.C321是一种特异的pser结合宿主菌株
磷酸丝氨酸掺入所需的第二种成分是一种修饰过的菌株，C321。ΔA.。由于磷丝氨酸OTS识别标记琥珀色终止密码子，在未经修饰的菌株中使用OTS将导致许多终止密码子的通读翻译，并对细胞生长产生不利影响。C321。Δ用TAA (7.)．这种修饰允许释放因子1的缺失，释放因子1是针对orf中TAG序列的存在而负责终止翻译的蛋白。在该菌株中，TAG是一个“开放”密码子，可被Sep-tRNA特异性识别。
3.编码要表达的ORF的表达质粒
最后，研究者需要一个质粒来编码他们感兴趣的开放阅读框架。Rinehart实验室已经验证了两种表达系统：pCRT7 NT TOPO E17TAG GFP和pGEX-6P-1。pCRT7 NT TOPO载体中含有一个突变体pSer-containing GFP，可作为优化实验的阳性对照。GFP的这个版本将包含一个磷酸丝氨酸在氨基酸17代替谷氨酸系统感兴趣的可以通过生产验证第一个完整的蛋白质(标签密码子编码磷酸丝氨酸应该而不是终止密码子,这将允许翻译完整GFP),其次,通过使用PhosTag系统的凝胶位移分析(见下文)。这个质粒主干也可以用一个感兴趣的ORF来克隆，用于定制实验。一旦感兴趣的ORF被克隆到这些表达载体中的一个，将被磷酸化丝氨酸取代的氨基酸的密码子必须通过定点突变被编码为“TGA”。在C321。ΔA.菌株，该TGA将被Sep-tRNA识别，并在该位点翻译特定的磷酸丝氨酸残基。
实验的实用提示
为了产生尽可能多的pser结合蛋白，一些优化将是必要的。首先，应该使用标准的蛋白质纯化策略优化蛋白质生产;应根据诱导温度和诱导长度等参数优化表达，这些参数在不同蛋白之间会有所不同。除了这些标准考虑之外，重要的是确定有多少磷酸化丝氨酸实际上已被纳入全长蛋白。E17TAG GFP中含有高达80%的p-Ser，使用莱茵哈特系统(6.）;然而，由于p-Ser结合蛋白的稳定性不同，以及UAG抑制的背景特异性效应，不同的蛋白质可能实现不同的合并水平，如所述(6.)．确定化学计量的phospho-incorporated non-phospho-incorporated蛋白质纯化系统,研究人员可以在sds - page凝胶含有Phos-Tag运行样本,专门一个小分子结合磷酸根和促进一个健壮的流动磷酸化的变化,但不是non-phosphorylated蛋白(8.)．定量磷酸化和非磷酸化带的比例将使研究人员对pser结合到非磷酸化蛋白的纯度有一个想法。位点特异性pSer掺入的验证也可以使用质谱来确定与感兴趣肽上的单个磷酸基团成比例的质量位移。
在确认pSer的掺入后，研究人员可以通过与未磷酸化或“野生型”的对照蛋白比较，证明pSer对酶功能、蛋白质相互作用等的影响。“野生类型”控件有两种方法。首先，用抑制基因tRNA (SupD)代替SepOTSl共同表达，可以在用于磷酸化丝氨酸合并的表达载体的TAG密码子上编码一个非磷酸化丝氨酸(6.)这将为研究人员提供使用相同表达质粒的磷酸丝氨酸和“野生型”（丝氨酸掺入除外）蛋白质群体。当为最初不是丝氨酸的残基创建磷酸丝氨酸掺入突变体（例如，将苏氨酸残基突变为磷酸丝氨酸）以控制氨基酸替代效应时，这是一个特别重要的控制。或者，您可以从同一质粒表达完全野生型蛋白质。
在证实丝氨酸磷酸化影响蛋白质功能后，研究人员应尝试通过磷酸酶治疗逆转pSer掺入对酶功能的影响。如果未知候选磷酸酶，CIP或其他通用磷酸酶可使pSer掺入的蛋白质去磷酸化，理想情况下可对表型进行检测更接近野生型蛋白质。如上文所述，可通过比较磷标记凝胶上的磷酸：非磷酸物种来跟踪去磷酸化反应的效率。
试剂和协议
pCRT7 NT TOPO E17TAG GFP质粒- Addgene #68295
如需进一步的技术参考和使用本系统的协议，请参考“用于改进重组磷蛋白表达的Rinehart实验室试剂，可在Addgene网站．
非常感谢客座博主Natalie Niemi!
Natalie Niemi博士是威斯康星州麦迪逊Morgridge研究所的博士后研究员。她对细胞信号、代谢和强大的线粒体的交叉点特别感兴趣。你可以在推特上关注她@nieminm．
参考文献
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