病毒基因组测序- AAV识别和血清型确认的一站式商店

我们的质量控制(QC)咒语的主要原则之一是尽最大努力确保科学家收到的材料与他们认为的完全一致。为了解决这个问题，几年前我们与Seqwell建立一个下一代测序(NGS) QC平台这使我们能够为科学家提供完整的质粒序列。在2016年推出病毒式传播服务后，我们对这个平台进行了调整腺相关病毒载体样本并创建了一个简化的过程，称为病毒基因组测序(VGS)，以确认我们的AAV制剂的身份和血清型。我们最近发布了VGS过程和用例的描述人类基因治疗．

AAV质量控制的现有方法

历史上，AAV矢量QC一直是稀疏包括AAV粒子的滴定用蛋白质染色来检测纯度。对于生产少量AAV制剂的实验室来说，这种水平的质量控制是足够的，但对于同时生产大量病毒制剂的病毒载体核心设施来说，存在混合样本、血清型或两者都存在的非常现实的风险。不幸的是，标准的AAV QC方案并没有解决这个问题。

以往的研究表明，NGS是确认AAV载体基因组身份的有效工具。这些研究使用SMRT测序，TA-based结扎和tagmentation-basedAAV基因组测序方法(Tai 2019;Lecomte 2015;梅纳德2019)。不幸的是，目前SMRT测序仅适用于自互补型aav，而之前描述的基于ta的连接和标记制备方法需要一个初步的双链步骤。双链步骤被认为是必要的，因为AAV基因组是单链的，而且基于ta的连接和标记都需要一个双链模板。

利用病毒基因组测序来验证病毒基因组

我们假设这个双链步骤实际上可能是不必要的。自AAV基因组以[+]和[-]股形式存在我们推断，在DNA提取之后，[+]和[-]链可能会自然地结合形成一个双链物种，可以作为下游应用的模板(Berns, 1972)。利用qPCR和限制性内切酶的方法，我们发现DNA提取物是单链和双链物种的非均匀混合。虽然DNA提取液中并非所有的分子都与互补链相关联，但混合物中存在足够多的双链物种，可以作为基于标记的文库制备过程的有效底物。这一发现消除了双链步骤，减少了AAV基因组测序的时间和成本。

图1:病毒基因组测序工作流。

利用这种简化的方法，我们对100多个AAV载体进行了测序，结果表明VGS可以快速可靠地确定AAV基因组的身份，并检测污染的AAV DNA。另外，我们写了开源自定义Python脚本利用VGS数据确定crea依赖的载体中重组的百分比，并确定AAV制剂的血清型。

利用病毒基因组测序确定血清型

AAV的包装并不完美，虽然我们认为AAV载体基因组只包含我们想要的表达盒，但它也包括来自包装细胞系、辅助剂和包装质粒的少量虚假DNA。我们决定利用这一点，设计一个Python脚本，在数据中查找预定义的血清型特定特征序列。与之前描述的基于热力学的血清型确认方法，该方法不需要任何额外的试剂或实验室工作(Pacouret, 2017)。此外，来自多个AAV批次的测序数据可以并行运行，并在几分钟内提供血清型数据，脚本可以很容易地定制，以检测其他感兴趣的序列。

虽然VGS过程对Addgene来说并不新鲜，但我们很高兴能与实验室和病毒载体核心分享该过程和Python脚本，并常规生产AAV。我们相信，这种简化的测序和分析方法可以很容易地纳入标准的QC方案，并将为科学家提供急需的保证，他们的研究材料正是他们认为的。

参考文献

Berns KI, Adler S(1972)含有互补多核苷酸链的两种腺相关病毒颗粒的分离。J病毒9(2):394-396。

Lecomte E、B Tournaire Cogne B,杜邦jb, Lindenbaum P, Martin-Fontaine M, Broucque F,罗宾·C Hebben M,莫顿O-W, Blouin对养V,弗朗索瓦,贺东R, Moullier P,分类帐(2015)高级特性的DNA分子rAAV向量由单链病毒制剂下一代测序。分子治疗-核酸4:e260。https://doi.org/10.1038/mtna.2015.32

Maynard LH, Smith O, Tilmans NP, Tham E, Hosseinzadeh S, Tan W, Leenay R, May AP, Paulk NK (2019) Fast-Seq:一种在学术环境中快速和廉价验证包装单链腺相关病毒基因组的简单方法。人基因治疗方法30:195-205。https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.110

Pacouret S, Bouzelha M, Shelke R, Andres-Mateos E, Xiao R, Maurer A, Mevel M, Turunen H, Barungi T, Penaud-Budloo M, Broucque F, Blouin V, Moullier P, Ayuso E, Vandenberghe LH (2017) AAV- id:一种快速、可靠的AAV制剂批间一致性评价方法。分子疗法25:1375-1386。https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.04.001

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