所以你想做一个很棒的实验，但它需要一些AAV。你以前从未与AAV合作过，但你不会让它阻止你。你从哪里开始？结果证明，和所有好的实验一样，制造AAV是从一些质粒开始的。你只需要三个质粒就可以开始了制造AAV:
- 这个包装质粒包含结构和包装基因，
- 这个腺病毒辅助质粒含有病毒复制所需的蛋白质，
- 和转移质粒它包含病毒基因组。
在今天的博客文章中，我们将关注AAV转移质粒，并查看其每个部分。
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| 图1:AAV转移质粒的部分。绿色部分是AAV质粒的关键元素。灰色显示的零件是可选的cis监管元件。 |
AAV质粒的关键元件
首先让我们谈谈AAV质粒的关键部分。
反向末端重复序列
倒置末端重复序列（ITR）使AAV转移质粒成为AAV转移质粒。ITR序列各有145个碱基，AAV质粒有两个ITR序列。ITR之间的DNA序列是包装到AAV分子中的。ITRs之外的内容不会打包到AAV向量中。ITRs之间的克隆容量约为4.4kb。
由于其二级结构、回文性质和高GC含量，ITR本质上是不稳定的。这种不稳定性可导致常规质粒繁殖过程中ITR的部分丢失，完全的ITR丢失可消除AAV包装。为了防止ITR丢失，最好在重组缺陷的细菌株（如STBL3）中繁殖AAV结构。ITR损失可以通过限制性消化酶检测，如SmaI，它在ITR中有识别位点。由于二级结构和高GC含量，常规Sanger测序通常无法通过ITR进行测序，但一些公司现在提供Sanger测序条件，可以读取这一具有挑战性的序列。
转基因
转基因是将由AAV传递的基因。在质粒图谱上，其序列位于ITRs之间。它可以是任何你喜欢的东西，只要它是~4.4KB或更小。一些例子包括像GFP这样的记者，一些较小的CRISPR-Cas蛋白，如SaCas9，CRISPR gRNAs或您感兴趣的基因。
发起人
这个发起人驱动AAV转基因的表达。在质粒图谱上，启动子位于它们控制的基因的上游或5′。启动子可以是生物体或组织类型特异性的，这可以帮助您将转基因的表达限制在特定的物种或位置。启动子也可以驱动不同的表达水平。例如，CAG是一个强大的启动子，可以驱动非常高的、普遍存在的表达，而人突触蛋白1启动子具有神经元特异性（Haery等人，2019年）。大多数AAV转移质粒都有启动子，但当转移质粒含有非编码序列时，不需要启动子。
其他独联体监管要素
接下来，我们来讨论一些AAV转移质粒中不需要的元素，但它们经常出现在AAV转移质粒中。
氧合酶位点
Lox位点和Cre重组酶结合用于时空控制转基因表达。Lox位点是定向的34 bp序列，位于转基因的两侧，位于ITR之间。转移质粒通常有两对lox位点，它们是双lox系统的一部分，称为弯曲或者迪奥。
Lox位点由重组酶Cre识别。Cre优先佛罗里达州ips第一对lox位点之间的序列，然后前任检查第二对之间的顺序。最终的结果是一个永久翻转的转基因。通过限制Cre的可用性，lox位点可以让研究人员控制转基因的空间和时间激活。
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| 图2:FLEX Cre Lox系统。 |
WPRE
土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调节元件（WPRE）在转录时形成三级结构，有助于mRNA的核输出，并有助于增加转基因的表达。WPRE位于AAV基因组的末端，就在最终ITR的上游。
波利亚
多聚腺苷酸化或polyA信号有助于RNA的核输出和RNA翻译，并促进RNA转录本的寿命。polyA位于AAV基因组的末端，位于最终ITR的上游和WPRE的下游。
TL；博士观看我们的AAV传输视频！
现在您已经对一些常见的AAV质粒元素有了基本的了解！虽然还有许多其他AAV质粒元素和组合没有在这篇文章中讨论过，但你已经掌握了设计成功和特异表达你感兴趣基因的结构的知识。
工具书类
Haery L，Deverman BE，Matho KS，Cetin A，Woodard K，Cepko C，Guerin KI，Rego MA，Ersing I，Bachle SM，Kamens J，Fan M（2019）用于靶向神经操作的腺相关病毒技术和方法。前神经管13:。https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00093
Wilmott P，Lisowski L，Alexander IE，Logan GJ（2019）腺相关病毒反向末端重复的用户指南。人类基因治疗方法30:206–213。https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.276
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