催化死亡Cas9蛋白(dCas9)以其结合DNA靶标而不改变它们的能力而闻名。因此，它被广泛应用于各种各样的领域:碱基编辑、CRISPR激活和抑制等。在过去的几年里，dCas9也变得非常强大可视化工具研究染色体的时空排列，以及这些排列如何影响核过程。最新的可视化工具是CRISPR-Sirius这是迄今为止最聪明的基于crispr的工具，用于可视化活细胞中的基因组位点。
之前使用CRISPR的基因组位点可视化工具的迭代
在2015年,Thoru Pederson的实验室马萨诸塞大学医学院开发了一种基于dcas9的药物多色标记系统可视化人类细胞中的染色体座（Ma et al.， 2015）.为此，他们将一种不同的荧光蛋白融合到不同的Cas9变体上，如SpCas9、NmCas9和St1Cas9。这些融合基于引导RNA序列定位于特定的位点。
一年后，它们发展起来了CRISPRainbow（Ma et al.， 2016)，一组gRNA支架，包含两个发夹序列(MS2、PP7或boxB)，每个发夹序列将不同的荧光蛋白(BFP、GFP或RFP)招募到感兴趣的基因组位点。一对相同的发夹在一个gRNA中会产生蓝色、绿色或红色的读数。但是，含有两种不同发夹的grna会根据发夹的组合产生第二种颜色(黄色、青色或品红)。包含这三种发夹的gRNA会产生白色。虽然CRISPRainbow可以同时显示活细胞中不同染色体上的位点，但该系统需要基因组中高复制的染色体特异性位点，而且指南相对不稳定。
发展CRISPR-Sirius
最近，马汉辉和Thoru Pederson实验室开发了CRISPR-Sirius (Ma et al.， 2018）.通过提高gRNA的稳定性，他们改进了以前基于crispr的基因座可视化工具。
首先，他们从西兰花适体系统来形象化活细胞中的gRNA。花椰菜核酸适体是与小分子DFHBI-1T结合以诱导其荧光的核酸序列。他们发现，与在gRNA的3 '端插入适配子相比，在gRNA的四环(gRNA内部的一个有四个碱基的发夹环基序)中插入适配子会产生更稳定的gRNA。
由于CRISPRainbow中MS2和PP7 RNA发夹序列的成功，他们知道它们可能是进一步开发的良好候选者。他们在gRNA四环中插入了一个MS2发夹的八重体，并进行了后续的设计迭代，以增加稳定性，并在将CRISPR-Sirius导入细胞所需的病毒生产过程中最小化错误折叠和重组。他们将该指南命名为sgRNA-Sirius-8XMS2，它将把带有红色荧光配体的HaloTag招募到感兴趣的位点。
双颜色检测
为了同时标记两个位点，Ma和Pederson创建了另一个包含PP7发夹序列的sgRNA (sgRNA- sirius - 8xpp7)，将GFP招募到感兴趣的位点上。为了确定sgRNA-Sirius-8XPP7和sgRNA-Sirius-8XMS2支架的表现，他们将它们与CRISPRainbow进行了正面对比。这两种工具都是针对FBN3内含子重复，包含22个拷贝的gRNA靶点。除了提高亮度，他们还发现CRISPRainbow的信噪比可以从2倍提高到3倍。
三颜色检测
第三个sgRNA包含交替的MS2和PP7序列(sgRNA- sirius - 4x (MS2-PP7))，在感兴趣的位点上产生黄色荧光，该团队可以可视化三个位点并测量位点间的距离。他们在第19号染色体上测试了这个系统，通过定位46个包含≥20个gRNA靶位点的重复位点。其中，46个位点中的26个在人类U2OS细胞中给出了可检测的信号。在此基础上，他们选择了一个基因间DNA区域(IDR3)作为参考位点，测量基因间区域、内含子区域和中心点周围区域的位点对之间的距离。结果与U2OS细胞拷贝数变异(CNV)分析一致。
为什么尝试CRISPR-Sirius ?
有了所有可视化基因组位点的工具，是什么让CRISPR-Sirius独一无二呢?与荧光原位杂交，基于crispr的可视化工具可以用于活细胞。与之前的CRISPRainbow相比，CRISPR-Sirius亮度更高，适合于观察低拷贝基因组位点或单拷贝基因。如果你想清楚地看到基因组位点，试试CRISPR-Sirius。
参考文献
马汉辉等，“人类细胞中染色体位点的多色CRISPR标记”。美国国家科学院学报112 10(2015): 3002-7。PubMedPMID: 25713381公共医学中心PMCID: PMC4364232．
Ma, Hanhui等，“利用CRISPRainbow用dCas9和工程sgrna多路标记基因组位点。”自然生物技术34(2016): 528 - 530。PubMedPMID: 27088723公共医学中心PMCID: 4864854．
Ma, Hanhui等，“CRISPR-Sirius: RNA支架在基因组成像中的信号放大。”自然方法15(2018): 928 - 931。PubMedPMID: 30377374．
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