可视化蛋白质的原地转换

这篇文章由客座博主Eugenia Rojas贡献。

一个值得读博士学位的问题:你如何想象神经元内蛋白质的转换?

在攻读博士学位时，我研究了一种与神经退化．阿尔茨海默病患者大脑中这种蛋白质的水平会降低。然而，目前尚不清楚为什么或如何发生这种情况。因此，我开始研究神经元中蛋白质的转换是如何调控的。

蛋白质转化是蛋白质合成和降解的综合作用。这些过程控制着细胞中蛋白质的丰度。蛋白质丰度的稳态调节对正常细胞功能至关重要，而且，因为我在研究突触蛋白，我想测量它在正常神经元环境下的水平。换句话说，我需要一种可视化蛋白质转换的方法原位在神经元。

研究蛋白质周转的经典方法是放射性脉冲追踪实验。然而，这些实验是有问题的，因为它们需要放射性标记的氨基酸。放射性材料的使用受到高度管制，需要指定的工作区域，并存在健康风险。重要的是，用这种方法不可能跟踪单个蛋白质的更替原位。

用于特定蛋白质的可视化原位免疫细胞化学可能是最常见的方法。用一种好的特异性抗体和合适的显微镜装置，我们可以在神经元或任何其他类型的细胞中观察到一种特定蛋白质的整个种群。然而，我们无法在这个库中区分新的和旧的蛋白质。因此，蛋白质合成的定位是不可能可视化的。

另外,荧光蛋白标记可用于促进细胞中特定蛋白质的可视化。标记蛋白很容易从质粒中过表达，但过表达可能会干扰系统。研究蛋白质合成的另一种方法原位是将荧光标记敲入感兴趣的基因位点。这种替代方案的一个优点是实时成像的可能性。罗伯特的歌手他在爱因斯坦医学院的实验室最近发表了在活的单细胞中追踪转译的技术。然而,在CRISPR-Cas9这些技术相当乏味，即使在这里，也存在标签是否影响行为的问题。

一次会议，一次突破!

在我读研究生期间，我参加了一个叫做“分子生物学的视野”的科学研讨会。这个年度研讨会是由德国马克斯普朗克生物物理化学研究所(Göttingen)的国际博士生组织的。我参加这个研讨会是为了寻求灵感来解决监测特定蛋白质的蛋白质周转的技术难题原位．我很幸运，因为我参加了一个非常有趣的讲座。艾琳·M舒曼他曾是加州理工学院的研究员，现在是德国梅茵河畔法兰克福的马克斯·普朗克大脑研究所的主任。她提出了一项新颖的技术，那时候还没有出版，它可以使特定的事物形象化新创合成的蛋白质原位．我很荣幸被邀请到法兰克福的MPI向他们学习，并进行类似的实验。

用FUNCAT可视化新合成的蛋白质

舒曼教授的技术应用了代谢标记使用非典型氨基酸叠氮同型丙氨酸(AHA)。在这项技术中，AHA被加入到新合成的蛋白质中，而不是蛋氨酸。标记的蛋白质可以通过点击化学检测，它将含有AHA的叠氮化合物共价连接到荧光炔标签上。新合成和标记的蛋白质可以用荧光显微镜观察。这种AHA标签的应用被称为fluorescencenoncanonical一个米诺酸t标记(FUNCAT因兹等。自然神经科学,2010年)，并允许可视化整个新创合成的蛋白质组。然而，FUNCAT单独不能用于确定某一特定蛋白质的周转．Schuman教授的实验室表明，通过将FUNCAT与邻近连接分析(PLA)相结合，FUNCAT的有效性可以扩展到确定特定蛋白质的周转情况。

FUNCAT和PLA的巧妙结合

PLA最初由瑞典Söderberg实验室发表，作为一种可视化蛋白质相互作用的方法原位．在标准PLA检测中，一抗直接针对两个内源性蛋白，怀疑相互作用，添加到细胞样本。两种抗体都有一个短抗体特异性DNA链加入其中。只有当感兴趣的蛋白质彼此接近时，DNA链才能参与滚圈DNA扩增。扩增的DNA片段用荧光探针标记，使蛋白质相互作用的位置可视化。

研究蛋白质水平在原地,Schumann实验室使用了PLA的改良版本，其中一个抗体指向感兴趣的蛋白质，而第二个抗体指向AHA。现在，只有当两种抗体识别到一种内源性蛋白，并且在一段确定的时间内，在脉冲标记后也加入了AHA标签，滚动圆扩增才能发生。因此，只有新合成的蛋白才会被FUNCAT-PLA检测到，然后被可视化。

在这些方法结合之前，不可能可视化的具体新合成的内生蛋白质原位．目前，FUNCAT-PLA提供了关于任何细胞类型中特定内源性蛋白周转的定量和时空信息。令人兴奋的!

非常感谢我们的客座博主Eugenia Rojas!

Eugenia Rojas博士是一位神经科学家，他一直对神经生物学非常感兴趣。她热衷于向所有观众传播科学。现在，她是一名科学讲师波士顿的创新研究所．当尤金妮娅不在显微镜下的时候，她喜欢旅行，发现新的餐馆，去听音乐会和烘焙。你可以和她联系rojas@ti2learning.org．

参考文献

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6.Buxbaum, Adina R.， Bin Wu, and Robert H. Singer。神经元中单个β-肌动蛋白mRNA的检测揭示了调节其可译性的机制。科学343.6169(2014): 419 - 422。PubMedPMID: 24458642．公共医学中心PMCID: PMC4121734．

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