调节翻译是细胞功能的关键，尤其是在开发或压力期间。含有核糖体剖析，研究人员能够研究各种刺激对全球翻译的影响，而是一种学习翻译的视觉技术仍然难以捉摸。由此开发的两种技术加入储层器通过以两种不同的方式更容易跟踪翻译：通过监测第一轮翻译或通过时间跟踪单个mRNA的翻译。两者都是帮助研究人员探讨了细胞生理学中翻译控制的复杂性。
核糖体谱
核糖体分析是2009年开发的一种生化方法，它拍摄了一张“快照”一个细胞中所有与mRNA结合的核糖体。当细胞的mRNA被核糖核酸酶消化时，核糖体保护与之结合的mRNA片段。这些区域随后被测序并与基因组对齐，以确定全基因组的翻译频率。尽管这项技术非常有用，但需要大量的样本避免干扰核糖体mRNA复合物的方法。最近的研究已经将这项技术应用于监测局部翻译，并确定蛋白质是否以共翻译或翻译后的方式靶向其目的地。
技巧：可视化第一轮翻译
核糖体剖面，同时选择核糖体的物理位置，技巧（T徘徊RNA.我杂乱无说C燕麦蛋白质KNock-Off）而是利用核糖体的运动。当核糖体沿mRNA移动时，它使其他RNA结合蛋白质取代以允许翻译。对于诀窍报告者MRNA，这种位移导致荧光信号的变化：未转换的RNA出现黄色，并且翻译的RNA出现红色。要启用此颜色切换，技巧需要以下组件：
- 一种通过PP7外壳蛋白与报告mRNA编码区结合的GFP蛋白(NLS-PCP-GFP)
- RFP蛋白通过MS2涂层蛋白与报告器mRNA的3'UTR结合（NLS-MS2-RFP)
- 报告器mRNA，其含有荧光蛋白的束缚点，并由诱导型启动子驱动（质粒金宝搏app下载64542或者64543)
在翻译之前，GFP和RFP都与报告者绑定，使其显示为黄色。翻译的行为将NLS-PCP-GFP从mRNA上推出，只留下一个红色的FP与报告者结合。由于NLS-PCP-GFP含有核定位信号，因此NLS-PCP-GFP随后返回细胞核与同源的未翻译mRNA结合。该系统的高特异性和分辨率是通过使用PP7和MS2外壳蛋白结合位点的多个拷贝将FP外壳蛋白融合的多个拷贝系到它们的报告mRNA来实现的。使用翻译抑制剂环己酰亚胺和嘌呤霉素，Halstead等人。验证了翻译是从技巧记者中删除GFP所必需的。
已知延迟翻译在开发中是重要的，并且Halstead等人。用法检查果蝇图案化基因的翻译奥斯卡。早期发展，奥斯克-TRICK reporter被双重标记，表示翻译抑制。在后期阶段，单个RFP标记为奥斯克Oskar蛋白水平与GFP强度呈负相关，表明TRICK是相对报告翻译的准确读数。
单分子连续平移跟踪
技巧允许您看到第一轮的翻译，但它不允许继续跟踪给定的mRNA，因为通过翻译mRNA的第一核糖体去除NLS-PCP-GFP。允许跟踪时间，Yan等人。设计了一个标记mRNAs及其相应的新合成蛋白质的系统。与TRICK系统一样，报告mRNA的3'UTR由PCP mCherry标记（图2）。3'UTR还包含一个CAAX序列，将mRNA结合到质膜上；这个序列阻止了mCherry标记的mRNA的扩散，并将其保持在一个单一的视野中进行持续跟踪。然后你可以直接监控来自这个单一mRNA的多轮翻译；你可以看到单分子水平上的平移动力学。
Yan等人的编码序列。的记者含有24份SunTag，一种合成支架，可以募集到阳光特异性抗体SCFV融合的GFP。每次报告者被翻译时，新生多肽上的Suntag网站都会募集SCFV-GFP，产生与红色报告器mRNA结合的绿色斑点。Yan等人。使用哈林顿胺，一种翻译抑制剂，其在引发后停止核糖体，计算核糖体的易位率为〜3.5密码子/秒。他们还探讨了5'UTR变体在细胞周期蛋白质EMI1翻译中的影响，显示〜80％的长5'UTR的转录物翻译沉默。
这两种方法都增加了我们对翻译动态的理解，但它们都有一些警告。在这两种情况下，创建报告mRNA需要将多个发夹序列插入编码序列和3'UTR。在开始实验之前，重要的是要验证这些变化不会像这些论文的作者那样影响翻译率。由于基于SunTag的系统将mRNAs系在质膜上，因此不适合与通常在特定隔室中翻译的mRNAs一起使用。尽管有这些限制，这些技术仍然是研究各种细胞类型和生理状态下翻译的有力工具。
参考
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- 找到核糖体分析质粒在Addgene。
2.翻译。一种RNA生物传感器，用于对从单个细胞到活体动物的第一轮翻译进行成像科学347(6228) (2015): 1367-71.PMID:25792328PMCID：PMC4451088.
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3.燕，Xiaowei，等。“体内单mRNA分子翻译的动态。”细胞165(4) (2016): 976-89.PMID：27153498.PMCID:PMC4889334
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