Crispr - 11月2021年11月是什么

现在是另一个版本的“克里普尔特是什么”的时候 - 在那里我们突出了addgene提供的一些最新的Crisp质粒。如果您想阅读与CRISPR技术相关的更多内容，订阅我们的CRISPR博客内容。

在这篇文章中，我们将介绍:

• 微型CRISPR-CAS系统
• 送质粒
• Prime编辑改进

微型CRISPR-CAS系统

经过布鲁克布里达

常用的有一个缺点链球菌CRISPR/Cas9系统是由于它太大而不能有效地包装成AAV颗粒并递送到哺乳动物细胞中，特别是当它与效应蛋白融合用于基因激活或基因编辑时。最近从未培养的古生菌中发现的Cas12f系统要小得多，很适合这种AAV包装，但它们在哺乳动物系统中的活性一直存在疑问。三个不同的实验室最近发表了研究成果，为这个问题提供了解决方案。

用于哺乳动物使用的微型CRISPR-CAS系统

Stanley Qi的实验室已经开发了一个微型Cas系统(CasMINI)，该系统由未培养的古菌Cas12f (Un1Cas12f1，或Cas14a1)系统改造而成。CasMINI系统是通过工程Cas12f支架gRNA，并在Cas12f的DNA结合腔中进行战略性突变而开发的。CasMINI系统的尺寸不到基于Cas9或Cas12a的系统的一半，这使得它非常适合于AAV封装。最重要的是，该CasMINI系统被证明对哺乳动物细胞的CRISPR激活、碱基编辑和基因组编辑有效。“V4”版本(名为CasMINI)具有最高的活动基因激活和基础编辑，而另一组突变(“V3.1”版本)最适合基因组编辑有活性的核酸酶。

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高效CRISPR编辑超紧凑Cas12f1和工程指导rna

Yong-Sam Kim的实验室还创建了一个微型但活跃的Cas系统，从同一个Un1Cas12f1 (Cas14)开始。他们注意到Cas12f1有一个超长的gRNA，因为它的小尺寸。他们通过5轮gRNA工程强化重组gRNA支架，从而提高了活性并减小了gRNA的大小。他们没有修改Cas12f1酶。结果是一个高效的Cas系统，具有非常紧凑的基因组编辑器和缩小了近40%的gRNA。这些修饰后的Cas12f1的活性与SpCas9相当。该团队还证实，Cas12f1和修改后的gRNA在AAV系统中传递时，在基因组编辑中是有效的，并证明新的系统能够通过融合dCas12f到VP64来激活表达。

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微型CRISPR-Cas12f核酸酶程序化基因组编辑

Quanjiang Ji的实验室描述了一个有效的微型CAS系统，它利用来自不同物种的Cas12F，Acidibacillus sulfuroxidans, AsCas12f1。他们发现，这个系统，没有任何修改，在细菌和人类细胞中使用各种传递方法，包括质粒、核糖核蛋白和AAV，有效地进行基因组编辑。

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选择性内源性封装rna的细胞传递

经过迈克花边

逆转录病毒样蛋白PEG10特异性结合自己的mRNA，促进其包装成病毒样颗粒。张峰的实验室对原生PEG10 RNA序列进行了调整，以替代驱动衣壳中货物序列的打包，这种方法被称为S.选择E.ndencenousouseN.capsidation细胞D.elivery（发送）。它们展示了用于包装，分泌和递送特定RNA的模块化系统，例如CRE mRNA或Cas9 mRNA，在人和小鼠细胞中。他们进一步开发了具有假型病毒颗粒的基因转移的发送版本，扩展了Crispr或其他基因递送的选择。

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图1：在模块化系统中发送内源性GAG同源物，货物RNA和致致致致致致致致致致密性，以将基因编辑工具递送到细胞中。图像改编自席格尔等，2021年。

Prime编辑改进

经过安吉拉•福尔摩斯

几个实验室最近分享了一些激动的质粒工具来优化素数编辑系统。

工程pegrna提高了prime编辑效率

两年以来大卫刘集团推出了素质编辑，他们继续建立在制度的生物学知识上，以优化其结果。在他们最近的工作中，刘实验室提高了素质编辑的效率，以纠正各种靶基因和细胞类型的突变。他们的自然生物技术纸张展示了引导RNA的改进设计，其用结构化RNA基序盖住3'末端。这些工程化的PEGRNA（EPegNAs）通过细胞外切核酸酶保护RNA免于降解，并逐渐提高编辑效率。

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通过操纵MMR机械增强素数编辑系统

在他们的细胞纸中，刘实验室发现，不匹配的修复（MMR）干扰了主要编辑中间体的所需分辨率。在其先前工作的PE2和PE3系统上，开发了一种系统，其中通过MLH1（PE4 = PE2 + MLH1DN和PE5 = PE3 + MLH1DN中的显性负突变，蜂窝MMR机械被破坏。在预期的编辑附近添加的静音突变进一步削弱了MMR机械的识别和改进的编辑效率。该实验室还优化了主要编辑器的架构和氨基酸序列，屈服于Pemax，用EPegNAS和PE4和PE5协同工作。这些增强的主要编辑系统在治疗相关的基因靶标中改善基因编辑性能，并将应用扩展到可能的遗传疾病治疗。

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精确的基因组缺失

在由Jay Shendure实验室开发的PRIME-del中，配对的pegrna与Liu实验室的PE2酶合作，以针对相反的DNA链并指定一个大的干预缺失。这种方法不仅能够精确地编程多达10kb的大基因组缺失，而且还能够编码并发的小插入，以允许帧内缺失，并引入表位标记和RNA转录起始位点。该实验室进一步证明了prim -del可以使用池成对的pegRNAs“多路复用”。

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长基因组序列的删除和替换

由Wen Xue的实验室工程设计的迈尔德战略也使用靶向DNA链的配对PEGRNA来编程有或没有小插入的大型基因组缺失。而是，佩德尔将该删除过程耦合到具有完全活性的Cas9酶的素编辑酶。PE-CAS9包括融合到逆转录酶（RT）的活性CAS9，其诱导两个双链断裂并删除介入序列。与其他PRIME编辑工具一样，所需的编辑是由PEGRNA的3'扩展的模糊。Pedar能够校正酪氨酸血症小鼠模型中所证明的较大基因组重排，其中FAH基因内的致病插入精确地校正，恢复肝脏中的表达。

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