这篇文章由客座博客作者Joachim Goedart撰稿，Joachim Goedart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和van Leeuwenhoek高级显微镜中心的助理教授。
绿色荧光蛋白是最流行、使用最广泛的基因编码荧光探针。有几个因素促成了GFP的流行，包括（i）在几乎所有生物体和细胞类型中快速完全成熟为功能性荧光蛋白，（ii）无需添加辅助因子，（iii）使用荧光显微镜上的标准滤光片组易于观察，最后（iv）融合蛋白具有良好的耐受性。
由于GFP是一种经过充分验证、性能全面的探针，因此在选择基因编码荧光标记时，它是首选。然而，如果您选择使用它，您可能会遇到许多限制。下面将讨论其中一些限制和可能的解决方案。
有许多GFP变体。这里我使用的名称是“GFP”，它指的是mEGFP。这种变体是通过在原始水母GFP（AvGFP）中引入两种突变（F64L，S65T）来产生增强型GFP（EGFP），一种亮度提高的变体(钱，1998年).另一个突变（A206K）是产生严格单体EGFP变体mEGFP所必需的(Zacharias等人，2002年).
绿色荧光蛋白需要氧气
生色团的形成需要完全折叠的β-桶结构，然后是产生生色团的分子内反应（Tsien，1998）。重要的是，该反应需要分子氧，因此GFP在厌氧条件下保持非荧光。这适用于任何AvGFP和珊瑚衍生荧光蛋白。因此，GFP不适用于需要厌氧条件的应用。金宝搏app下载
在需要厌氧条件的实验中，可以使用结合内源性荧光辅因子的蛋白质。例如结合黄素的LOV结构域(Buckley等人，2015年)或者结合胆红素的UnaG蛋白(熊井，2013年).除了这些天然存在的辅因子结合蛋白外，还设计了蛋白质结合合成荧光类似物的系统(索恩，2017年)。这些荧光类似物通常添加到沐浴液中，需要细胞摄取。这些策略中哪一种最适合厌氧条件下的特定生物系统，需要根据具体情况进行检查。
绿色荧光蛋白对酸敏感
GFP的发色团可以质子化和去质子化状态存在（Tsien，1998）。脱质子化状态的最大吸光度约为488 nm，其发光峰值为508 nm。然而，质子化状态在488 nm处不吸收光。这两种状态之间的比率由pKa反映，GFP约为6.0。该数字表明，在pH值为6时，只有50%的可用绿色荧光蛋白发射l嗯。金宝搏app下载
美国的pKa金宝搏app下载可准确测定体外通过测定不同酸浓度下纯化蛋白的荧光强度。综述了不同荧光蛋白的pKa值(Cranfill等人，2016年和FPbase.org).许多变体在酸性条件下保持荧光，pKa值低于4。示例包括mTurquoise2（pKa=3.1）、tagRFP（pKa=3.1）和mCherry（pKa=3.8）。我们观察到mCherry（和mTurquoise2，未显示）在酸性细胞器中保持荧光(图1)，表明其耐酸性在细胞中得以维持。
GFP很大
GFP是一种28kDa的蛋白质，类似圆柱体，长度为4.2nm，直径约为2.4nm(Hink等人，2000年)。完整的β桶是其荧光所必需的，因此不能通过删除残基来缩小GFP。只有约10个氨基酸可以从C端删除，约5个氨基酸可以从N端删除，但这几乎不会减小其大小。GFP的巨大大小可能会干扰融合蛋白的活性或定位n、 此外，在感兴趣的蛋白质相对较小的情况下，添加GFP可能会改变扩散速率。
较小的基因编码探针基于上述辅因子结合蛋白。最小的标签是经过工程设计的肽，其特异性结合并与荧光团具有高亲和力。例如闪光标签、他的标签和其他几个标签。另一种基于肽的策略使用酶以荧光团共价标记肽。这两个系统都是基因编码标签和外源添加成分的混合体。有关评论，请参阅Lotze等人（2016年）迄今为止，完全由基因编码的小探针尚不存在，但非天然荧光氨基酸的开发及其与蛋白质的结合是朝着这个方向迈出的一步(Chatterjee等人，2013年;Hilaire等人，2017年).
GFP只能用于标记蛋白质
GFP融合蛋白是通过将其DNA代码连接到另一种蛋白质的编码cDNA来制造的。有效地，它为感兴趣的蛋白质配备了一个额外的蛋白质模块，可以报告位置。这种方法可以研究细胞中的蛋白质，但不能研究其他感兴趣的生物分子，如DNA、RNA和脂质。尽管如此，这些分子通过使用特异性结合感兴趣分子的蛋白质结构域，可以间接地观察到s。例如，pleckstrin同源结构域可用于检测特定的磷脂酰肌醇(瓦尔奈和巴拉，2008年) (图2）.
RNA的产生可以通过使用专门检测特定RNA干环结构的MS2外壳蛋白来检测(克雷多和沙特兰，2008年)最后，缺乏核酸酶的Cas9可以结合基因组中由gRNA定义的位点。由于Cas9是一种蛋白质，与GFP融合可以检测基因组位置(陈等人，2013年).
GFP荧光与自体荧光重叠
用于激发GFP的青色光也可能激发细胞或培养基中自然存在的几种成分。这些“自体荧光”的来源包括培养基中的核黄素或哺乳动物细胞中含有黄素的蛋白质。一般来说，当激发波长移到较长波长时，自发荧光问题较少。因此，使用亮红色荧光蛋白（如mScarlet）或红外荧光蛋白(金宝搏app下载Chernov等人，2017年)可能提高检测。由于波长越长，组织穿透性越好，（红外）荧光蛋白对于较厚的样本也是更好的选择。金宝搏app下载
另一种避免自体荧光的解决方案是生物发光蛋白。这些探针通过化学反应产生光，因此无需激发样品。尽管生物发光探针通常比荧光探针暗，但最近的工程努力提高了这些基因编码的l发光体（即。Takai，2015年和Iwano等人，2018年).
GFP在我的融合中是不能容忍的
将GFP连接到另一种蛋白质的N端或C端是标准做法。然而，这可能会干扰蛋白质的功能。当蛋白质通过脂肪酰基链进行翻译后修饰时，情况显然是这样。例如，肉豆蔻酰化需要N端一致序列（MG-）丙烯酰胺化需要一个C-末端共有序列（-CaaX）。当GFP与这些序列融合时，这两种修饰都会被破坏。
当N-端和C-端融合不能耐受时，另一种选择是将GFP插入感兴趣蛋白质的编码序列。这种方法效果良好的原因之一是GFP本身的N-端和C-端相对较近，从而最大限度地减少对目标蛋白质的破坏。这样，我们（和其他人）已经成功地产生了几个功能性异源三聚体G-α亚单位融合，这些融合不能耐受N端和C端融合(Adjobo Hermans，2011年).结构信息有助于选择合适的位置，尽管生成几个变体并检查融合功能仍然是值得的(马斯托普，2018年).
总结
GFP是一种全方位有用的基因编码探针，但也存在局限性。了解这些局限性对于成功使用GFP或任何其他基因都很重要其他荧光蛋白金宝搏app下载. 幸运的是，许多局限性通常都有解决方案，随着全球众多科学家不断努力产生的不断扩大的基因工具箱，绿色荧光蛋白替代品的数量有望增加。
非常感谢我们的客座博主Joachim Goedhart！
Joachim Goedhart是分子细胞学和Van研究科的助理教授列文胡克高级显微镜中心（阿姆斯特丹大学）。他开发、表征和使用基因编码的荧光探针。你可以在推特上关注他：@约阿希姆戈德哈特.
工具书类
1.Zacharias，David A.等人，“脂质修饰单体GFP在活细胞膜微区中的分配。”科学296.5569（2002）：913-916.PubMedPMID:11988576.
2.Tsien，Roger Y.“绿色荧光蛋白”，（1998）：509-544.PubMedPMID:9759496.
3.Buckley，Anthony M.等人，“基于LOV的荧光成像记者。”化学生物学的最新观点27（2015）：39-45。PubMedPMID:26087123.
4.Kumagai，Akiko等人，“鳗鱼肌肉中的胆红素诱导荧光蛋白。”单间牢房153.7（2013）：1602-1611.PubMedPMID：23768684.
5.Thorn，Kurt.“基因编码荧光标签”细胞的分子生物学28.7（2017）：848-857.PubMedPMID：28360214公共医疗中心PMCID:PMC5385933.
6.Cranfill，Paula J.等人，“荧光蛋白的定量评估。”金宝搏app下载自然方法13.7 (2016): 557. PubMedPMID:27240257公共医疗中心PMCID:PMC4927352
7.Hink，Mark A.，等人，“绿色荧光蛋白与单链Fv蛋白融合的结构动力学。”生物化学杂志（2000年），PubMedPMID:10748019.
8.Lotze，Jonathan等，“用于体外和体内位点特异性蛋白质标记的肽标签。”分子生物系统12.6 (2016): 1731-1745. PubMedPMID：26960991.
9.Chatterjee，Abhishek等，“哺乳动物细胞中遗传编码的荧光探针。”美国化学学会杂志135.34（2013）：12540-12543.PubMedPMID:23924161公共医学中心PMCID:pmc378314。
10.Hilaire，Mary Rose等，“用于生物光谱和显微镜的蓝色荧光氨基酸。”美国国家科学院院刊114.23（2017）：6005-6009.PubMedPMID：28533371.公共医学中心PMCID：PMC5468623.
11.Várnai，Péter和Tamas Balla，“表达肌醇结合蛋白结构域的磷酸肌醇活细胞成像。”方法46.3 (2008): 167-176.PubMedPMID:18930153公共医疗中心PMCID:pmc264460.
12.Querido、Emmanuelle和Pascal Chartrand.“使用荧光蛋白研究活细胞中的m金宝搏app下载RNA运输。”细胞生物学方法85（2008）：273-292.公共医学PMID：18155467.
13.Chen，Baohui，et al.“通过优化CRISPR/Cas系统动态成像活体人类细胞中的基因组位点。”单间牢房155.7（2013）：1479-1491.PubMedPMID：24360272.公共医学中心PMCID：PMC3918502.
14.Chernov，Konstantin G.等人，“近红外荧光蛋白、生物传感器和光敏色素工程光遗金宝搏app下载传学工具。”化学评论117.9（2017）：6423-6446.PubMedPMID：28401765.
15用于实时多色发光成像的纳米灯笼扩展调色板美国国家科学院院刊(2015): 201418468.PubMed采购经理人指数：25831507公共医学中心PMCID:PMC4394297.
16Iwano，Satoshi等，“自由活动动物深部组织的单细胞生物发光成像。”科学359.6378（2018）：935-93.PubMedPMID：29472486.
17.Adjobo Hermans，Merel JW等，“活细胞中异源三聚体G蛋白Gq激活的实时可视化。”BMC生物学9.1 (2011): 32.PubMedPMID:21619590.公共医学中心PMCID:PMC3129320.
18.Mastop，Marieke等人，“一种基于FRET的生物传感器，用于测量单个细胞中的Gα13活化。”公共科学图书馆一号13.3（2018）：e0193705。PubMedPMID:29505611.公共医学中心PMCID:PMC5837189.
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