这篇文章是由客博主投稿的埃里克·l·Snapp．
停止使用EGFP/GFP来融合蛋白质!尽管在高知名度的期刊文章中进行了多项研究，但许多研究人员仍然不知道EGFP/GFP容易形成非共价二聚体。EGFP的这种特性可能导致显著的伪影。
如果您正在使用绿色荧光蛋白或增强型绿色荧光蛋白(GFP/EGFP)作为转录报告，或作为细胞的一般细胞质标记，都没有问题。你是好的。然而，如果你将你感兴趣的蛋白质(POI)与绿色荧光蛋白融合，以研究蛋白质在细胞、溶液或两者之间的行为，你使用的是一个有严重缺陷的标签。Clontech曾经出售的标准EGFP质粒，在世界上几乎所有实验室的冷冻箱里都有，它不是惰性的。严肃地说，EGFP/GFP具有非常重要的非共价二聚的倾向。这意味着你的POI融合到GFP或另一种荧光蛋白(FP)可能在细胞中形成二聚体。你为什么要关心这个?下面列举了三种二聚FP会毁掉你一天(和实验)的简单方法。以下是避免这些常见问题的解决方案。
这是注意力的问题
自然界中大多数FPs易于二聚(即EGFP) [1，2]甚至形成专性四聚体（即DsRed）[3.].这是融合蛋白的问题。FPs的主要应用之一是可视化POI的定位、动力学和行为。作为一个研究者，你希望一个融合标签是惰性的，不会在你的实验中产生伪影。在制备FPs单体方面已经付出了相当大的努力，但许多研究人员仍然对FP二聚体一无所知。同样有问题的是，据报道有几个单体FP实际上不是单体的，至少在实际应用中是这样。特定类型分子形成二聚体的倾向取决于其分子亲和力，称为离解常数或Kd，以及它的浓度Kd，则更可能与特定类型的分子发生相互作用。具有纳摩尔的蛋白质Kd将主要以二聚体形式存在于细胞中，而蛋白质具有高微摩尔数或低微摩尔数Kd不太可能在细胞中形成二聚体。的KdEGFP的平均粒径为0.11mm[2］.按照上述简单的逻辑，你可能会认为EGFP不太可能在细胞中形成二聚体。不幸的是，事情并非如此简单。
浓度是一个体积内的分子数。在许多生物学研究中，相关的体积是细胞的体积。为了准确预测与分子浓度相关的物理行为，假设分子在整个体积内均匀分布，并且可以在720°自由翻滚。然而，如果分子局限于细胞的一个亚区，并且/或者它们不能以720°的角度旋转，即它们位于膜上或细胞器中，那么它们的有效浓度将比它们均匀分布并在整个细胞中移动时高得多。如果一个分子的两个拷贝是一个融合蛋白的一部分，如而生物传感器，则融合蛋白周围FPs的局部浓度非常高。细胞中这些情况的真实示例如下所述（见图1）。
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图1：说明了荧光蛋白二聚化的每个问题。1） 与FPs融合的二聚膜蛋白可以形成动金宝搏app下载态接触，将相邻的膜结合在一起，并将膜包裹成堆叠结构，包括有组织的滑面内质网（OSER）螺纹。2） 与二聚FP融合的感兴趣的二聚蛋白具有形成大的稳定二聚体聚合物的潜力。3） 含有两个二聚化FPs的FRET生物传感器可存在于开放非激活状态、闭合激活状态和由于FP二聚化而闭合的人工激活状态。 |
1.跨膜荧光蛋白融合
跨膜蛋白，即受体和转运蛋白，整合到脂质双层中。FP与跨膜蛋白融合显著增加FP的有效浓度。FP被限制在一个平面上，通常只旋转360°，增加了两个FP相互碰撞的可能性。后果可能是戏剧性的。对于定位于内质网的膜POI，如果二聚化FP与POI融合，则通常的蛛网状小管模式可严重扭曲为致密的堆叠膜，称为有组织的光滑内质网或OSER。这些结构大（微米），明亮，非生理性，难以忽视[1，2］.
2.与专性二聚体或低聚物融合
一些细胞蛋白质通常自缔合成同型二聚体甚至更高阶的低聚体。不幸的是，FP二聚与POI二聚结合会导致融合蛋白的聚合。二聚体融合蛋白将有两个FP结合域，随着融合蛋白浓度的增加，形成足以形成聚合物的构建块。由此形成的聚合融合蛋白往往定位错误，功能也可能不正常。
3.集成到FRET生物传感器中
一个而生物传感器是一种报告细胞，它经历了构象变化，使单个蛋白质上的两个FPs靠得更近或更远。距离的变化改变了一个FP向第二个FP无辐射传递能量的能力，通常从第一个FP降低荧光信号而从第二个FP增加信号。一些早期的FRET生物传感器是用CFP和YFP制成的，这两种绿色荧光蛋白的青色和黄色变体具有与绿色荧光蛋白同样的二聚化能力。因此，CFP和YFP二聚体可以在没有环境变化的情况下形成，而生物传感器旨在检测环境变化导致的假阳性[2，4］.
聚合物问题的解决方案
对于研究人员来说，有一些简单的解决方案可以解决所有这些问题。最简单和最好的解决方案是使用真正的单体FPs。EGFP和其他GFP家族成员(superfolder, Emerald, CFP, YFP, BFP, Cerulean, Turquoise, Venus, and Citrine)可以通过A206K突变进行单体化[2]Addgene有很多这些构造它们被命名为mGFP、mVenus等。需要注意的是，非GFP衍生的FPs，即红色FPs，即使在出版物中被描述为单体，也不一定是单体。用于确定蛋白质是否为单体的分析金标准是沉降平衡分析超速离心[2］.在描述上述FPs的论文中使用的一些亲和分析方法，包括分子尺寸色谱柱和天然凝胶，都不能检测到EGFP二聚。重要的是，所有这些检测都是执行的在体外．检测荧光蛋白二聚的方法在活的有机体内细胞环境，如CytERM whorl形成分析，是二聚潜力的实际测量，将确定FP是否会在实验相关环境中二聚。有关更详细的讨论，请参阅[5］.
问题1和2取决于蛋白质浓度。一个不完美的解决方案是将成像分析局限于表达最低水平融合蛋白的细胞。这可能会减轻适度二聚FPs（如EGFP）的伪影，但不会减轻专性低聚物（如DsRed）或高亲和力FPs（如TagRFP）的伪影。在大多数情况下，问题3可以通过使用不能形成异二聚体（即EGFP和mCherry）的单体FPs或来自不同家族的FPs来解决。这些简单的策略可以帮助你为你的研究制作更好的荧光融合蛋白报告器，并大大降低你找到实际结果的机会。
非常感谢我们的客座博主Erik L. Snapp!
Erik Lee Snapp从俄勒冈州健康科学大学获得了分子微生物学和免疫学博士学位，与美国国立卫生研究院的Jennifer Lippincott Schwartz进行了博士后研究，目前是阿尔伯特·爱因斯坦医学院解剖和结构生物学系的副教授他的兴趣包括内质网分泌蛋白的质量控制和活细胞成像方法。埃里克也是一名狂热的长跑运动员、加德纳和库克。
工具书类
1.斯纳普，e.l.等人，通过低亲和力蛋白质相互作用形成堆叠的内质网池。细胞生物学杂志，2003。163（2） ：第257-69页。PubMedPMID：14581454．公共医学中心PMCID:PMC2173526．
2.Zacharias，D.A.等人。，脂质修饰的单体GFP在活细胞膜微区中的分配。《科学》，2002年。296（5569）：第913-6页，PubMedPMID：11988576．
3.马茨，m.v.，等人，金宝搏app下载来自非生物发光珊瑚虫物种的荧光蛋白。纳特生物技术公司，1999年。17(10): 969 - 73页。PubMedPMID：10504696．
4.大西等，基于gfp的FRET实验研究及其在本质非结构蛋白中的应用。蛋白质科学，2007年。16（7） ：第1429-38页，PubMedPMID: 17586775．公共医学中心PMCID: PMC2206698．
5.Costantini，L.M.等人。，评估荧光蛋白在生理条件下寡聚的趋势。金宝搏app下载交通，2012年。13（5） ：第643-9页，PubMedPMID:22289035．公共医学中心PMCID: PMC3324619．
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