注:这篇博文，CRISPR核酸酶的选择:位点的可及性、特异性和敏感性，包含其他Cas蛋白选项(发表于2019年11月)。
CRISPR/Cas9的出现使高效地进行精确的、有针对性的基因组修改变得比以往任何时候都容易。Cas9已经被改进，使研究人员能够敲除，激活、抑制甚至想象你最喜欢的基因．但是，有这么多基于Cas9的试剂可用，你如何选择哪个Cas9适合你的特定实验呢?这篇博客文章将帮助您熟悉Addgene的存储库中广泛的Cas9s，并使您更容易选择适合您的Cas9试剂。
在任何CRISPR实验中要做的第一件事就是确定你到底想做什么。你是想永久性地敲除某一细胞类型或有机体中的某一基因吗?你是否试图在不永久修改基因组的情况下减少某个特定基因的表达?在一个特定的位点上尝试激活是否更有意义?在特定位置修改表观基因组又如何呢?如你所料，这个问题的答案将在很大程度上影响你决定你的实验需要哪一种Cas9。下面简要总结了几种常见的使用Cas9进行的基因操作，以及每种Cas9都可以使用的特定Cas9。
为你的击倒实验选择一个Cas9
用标准SpCas9进行基因敲除
敲除细胞或动物是通过共同表达特定于目标基因的gRNA和内切酶Cas9。基因组目标可以是任意~ 20个核苷酸的DNA序列，但必须满足两个条件:1)序列与基因组其他部分相比是唯一的。2)靶蛋白位于原间隔体邻近基序(PAM)的直接上游。当有合适的靶位点且很少考虑脱靶效应时(例如在整个基因组中具有最小同源位点的最佳gRNA设计)，SpCas9是一种常见的选择。Addgene携带多种SpCas9含有质粒在细菌、酵母、蠕虫、果蝇和哺乳动物身上进行基因组工程实验时，它们已经得到了优化。
特异性的担忧?考虑使用高特异性Cas9变异。
通过正确设计gRNA序列，可以增强cas9介导的切割的特异性。也就是说，选择一个在基因组其他地方具有最小同源性的目标序列。多种方法被用于进一步提高Cas9的特异性。例如,Cas9-nickase (Cas9n)利用Cas9通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH的联合活性产生双链断裂(DSBs)的事实。将两个关键酶残基中的一个转化为丙氨酸(D10A或H840A)会产生一个不能产生双链断裂的“缺口”Cas9。因此，需要两个合适的Cas9n分子在靶位点高效地创建dsb，相比野生型SpCas9，这大大提高了特异性。
虽然Cas9n确实比野生型SpCas9更特异，但当只有一个gRNA表达Cas9n时，在靶位点仍然可以检测到dsb。这意味着Cas9n有可能结合并在其任一grna的脱靶位点上产生indel。我们可以通过使用与非特异性核酸内切酶FokI融合的核酸死亡Cas9 (dCas9)来克服这一限制。FokI只在二聚体时切割目标DNA。因此,dCas9-FokI本质上需要在任何裂解发生之前，将两个dCas9-FokI分子靶向到目标位点;与Cas9n相比，dCas9-FokI在单个gRNA指定的切断靶点上的切断可能性要小得多。
Cas9n或dCas9-FokI方法的一个明显的局限性是，为了有效地生成DSB，它们都需要两个相近的合适的目标序列。包括布罗德研究所张峰(Feng Zhang)的实验室和MGH的Keith jung团队在内的几个实验室，已经利用结构生物学识别了介导Cas9切割脱靶位点能力的关键残基。所谓的“强化Cas9”(张)或“高保真Cas9”(jung)在靶位点具有与野生型SpCas9相当的裂解活性，但大大降低了脱靶活性。这些Cas9变异增强了特异性，而不需要在靶位点中有两个或更多相邻的靶位点。可以找到更多关于特异性增强的Cas9变异的信息在我们题为"利用eSpCas9和SpCas9-HF1增强CRISPR靶向特异性”．
如果没有5'NGG ' 3 PAM序列，我该怎么办?
- 新型PAM识别合成Cas9s
通过一系列对细菌的积极选择筛选，Keith jung的小组鉴定了化生链球菌Cas9的突变体(VQR, EQR和VRER Cas9变体)能够识别新的非ngg PAM序列。重要的是，VQR、EQR和VRER Cas9突变体能够修改野生型SpCas9无法修改的基因组位点，而且它们对PAM突变体的特异性与野生型SpCas9对人类细胞中的几个基因组靶标的特异性相似。包括VQR、EQR和VRER SpCas9变种，人类基因组内CRISPR/Cas9的靶标范围有效地翻倍。更多关于通过Addgene合成的Cas9s的信息可以在我们的博客中找到PAM要求与CRISPR在SpCas9之外的扩展．
- 非化脓性Cas9s
此外，从多种细菌中还分离出了Cas9同源物，其中许多与PAM序列结合，而不是典型的NGG PAM序列。所谓的“非sp”Cas9s可能更适合您的实验，原因不是PAM序列。例如，Cas9的编码序列金黄色葡萄球菌(SaCas9)比SpCas9小约1千碱基，这使得包装成腺相关病毒(AAV)成为目前基因治疗的金标准。重要的是要记住，非spcas9只与来自同一物种的tracrRNA和crRNA(或合成gRNA)兼容。更多关于各种非spcas9基因的信息可以在我们的博客文章中找到PAM要求与CRISPR在SpCas9之外的扩展．
- 非cas9 CRISPR内切酶，Cpf1
注:Cpf1也称为Cas12a。
Broad研究所Zhang实验室最近发现了一种新的CRISPR内切酶。这种非cas9 CRISPR内切酶被称为Cpf1是一种2级CRISPR内切酶，能够以RNA依赖的方式切割靶DNA。让Cpf1如此有趣的不是它与Cas9的相似之处(它有很多相似之处)，而是它们的不同之处。Cpf1的PAM序列为5' ttn3 '，位于靶位点5'处(与Cas9的PAM相反，它位于靶位点3'处)。该内切酶包含两个类似于Cas9的酶残基(D917和E1006)，但两个残基都位于RuvC结构域(Cpf1缺乏HNH结构域)，任何一个残基的突变都可以完全消除DNA切割。与SpCas9相反，SpCas9可以通过改变单个酶残体转化为镍酶。有趣的是，Cpf1切割导致一个5核苷酸5'悬垂18个碱基对从PAM序列。这与Cas9切割不同，Cas9切割的结果是钝的DNA末端位于PAM序列的远端3个碱基对。Cpf1的交错切割模式是否允许研究人员避免使用低效HDR-dependent通路基因编辑仍然有待证明，无论如何，Cpf1最令人兴奋的应用可能还没有到来。你可以找到Cpf1质粒和链接到发表Addgene网站再多读点关于我的t在我们的博客．
以上大多数Cas9变异已被用于生成特定的基因编辑同源定向修复(HDR)途径．看到我们的CRISPR指南页面上有更多关于如何使用CRISPR生成特定基因编辑的信息。
利用Cas9激活和抑制靶基因
Cas9的一个独特之处在于它能独立于靶DNA结合粘住目标DNA。换句话说，Cas9含有破坏DNA切割的突变(SpCas9的D10A和H840A)，仍然能够结合目标DNA。此外，所谓的核酸酶死亡Cas9或“dCas9”可以作为一个平台，通过直接与dCas9融合，将各种货物运送到特定的DNA位点。dCas9的这种特性已经被利用来定位多种蛋白质到靶基因，包括转录激活子和转录抑制子。
使用基于dcas9的阻遏因子抑制靶基因
早期使用dCas9的实验在细菌中发现，将dCas9靶向到转录起始位点足以通过阻断转录起始来“抑制”或“下调”转录。在哺乳动物细胞中，强大的抑制需要将标记有转录抑制子的dCas9靶向到相关基因的启动子区域。当敲除目标基因对细胞有毒时，你可能会考虑使用包括dCas9-KRAB在内的基于dcas9的阻遏因子。在多种物种和细胞类型中可以找到抑制靶基因的质粒Addgene的网站．
使用基于dcas9的激活剂激活靶基因
基于dcas9的激活器的种类非常多样。最简单的激活因子由融合到单个转录激活域的dCas9组成(通常是VP64)。第二代激活剂最近已经开发出来，这些激活剂使用几种不同的方法改变基因表达。例如,“SunTag”系统通过表位标记的dCas9和抗体-激活因子融合蛋白的共表达，有助于将多个激活域招募到同一遗传位点。的协同激活中介复合物由dCas9-VP64融合和修饰的gRNA组成，该gRNA能够与额外的rna结合转录激活子相互作用。在上面可以找到激活多种物种和细胞类型的靶基因的额外质粒Addgene的网站．
好的，我已经选择了一个Cas9!接下来我要做什么?
您已经选择了适合您的实验的Cas9。接下来你要做什么?以下是一些可以帮助你推进CRISPR实验的注意事项。
设计或选择gRNA - Addgene可能已经携带“验证gRNA”你最喜欢的物种的基因。经过验证的grna已经成功地用于实验，并发表在同行评议的期刊上，这将节省你开始CRISPR实验时的实验室时间和金钱。如果您需要为您的实验生成一个新的gRNA，您可以从各种“空gRNA向量”设计你的gRNA靶向序列使用许多免费的gRNA设计程序．
我应该使用什么类型的表达系统或传递方法?为你的实验选择合适的Cas9试剂只是战斗的一半——现在你必须选择合适的表达系统并将Cas9传递到你的目标细胞!Addgene携带多种含有Cas9的质粒，这些质粒已在不同物种和细胞类型中优化表达，包括(但不限于)细菌，酵母，植物，果蝇，蠕虫和哺乳动物(浏览质粒通过模式生物，在这里）．对于难以转染的细胞类型，您可能想要考虑使用慢病毒将Cas9传递到您的目标细胞。更多关于哺乳动物细胞的各种输送系统的信息可以在我们的博客中找到，CRISPR 101:哺乳动物表达系统和传递方法．
验证你的基因组编辑——一旦你把Cas9和gRNA送到你的目标细胞，是时候确认你的目标序列已经被修改了!具体的方案可能会根据你的具体实验而有所不同，但是在我们的博客文章中可以找到一个关于你可以验证你的基因组编辑的各种方法的广泛概述《CRISPR 101:验证你的基因组编辑》．
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
- 阅读我们的所有帖子CRISPR 101系列
- 了解不同Cas9变体的PAM要求
- 了解CRISPR聚合文库实验
Addgene网站上的其他资源
- 找到CRISPR质粒
- 用我们的节目来了解你的CRISPR背景CRISPR指南
- 找到软件工具的gRNA设计
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