我应该使用哪种荧光蛋白?

这篇文章由greenfluorescentblog．

要诚实。你真的知道荧光蛋白是如何发光的吗?金宝搏app下载

金宝搏app下载荧光蛋白(FPs)在50多年前首次被发现，当时发现了绿色荧光蛋白(GFP)，这是一种来自Aequorea Victoria水母的蛋白质。自从这个发现之后，FPs家族便不断壮大，出现了数百种不同的变体。读下去熟悉你自己可用的FP发射颜色和10点要记住，当选择一个(或两个)FP为你即将进行的实验。

荧光是物质吸收光后发出的光。发射的光的波长比激发光的波长长。因此，FPs是具有这种独特能力的蛋白质。

当这些FPs在大多数生物体中异位表达时，其中许多是荧光的。此外，将FPs融合到另一种蛋白质上通常不会影响其荧光。因此，FPs被用于研究许多生物学问题。最常见的两个用途是:1)在特定系统中检测表达水平(通过测量荧光强度);2)可视化FP(与感兴趣的蛋白质融合)的定位，从而跟踪该生物分子在活细胞内的定位。

按发射颜色(发射波长范围)分类的FPs

FPs通常按发射颜色分类，如下所示(或发射波长范围)。通过使GFP变异蓝色的《外交政策》(桶)青色《外交政策》(CFP),黄色的《外交政策》(YFP)。关于绿色荧光蛋白，它的变异，以及相关的突变，请查看马西上周发布的关于GFP的帖子．此外，在其他生物体中也发现了许多FPs。

除了发射波长范围，在选择FP时还需要考虑其他特性:

独特种类的荧光蛋白金宝搏app下载

• Photoactivatable / Photoconvertible当被特定的激发波长激活时，这些蛋白质可以改变它们的颜色。这意味着发射波长可以改变。在少数情况下，蛋白质的初始状态是无荧光的，因此允许非常低的本底荧光水平。这样的例子光激活或光转换蛋白分别是PA-GFP、Dendra2和mEOS蛋白。有些蛋白质是可逆的(如rsEGFP, Dreiklang)。
  
  
• 荧光计时器(英尺)这些蛋白质会随着时间改变颜色。因此，这些可以用作细胞进程的“计时器”后激活。四种主要的金融时报分别是Slow-FT、Medium-FT、Fast-FT和mK-GO。
  
  
• 大斯托克斯位移(LSS):斯托克斯位移(得名于乔治·g·斯托克斯)是波长从激发到发射的偏移。对于大多数FPs, Stokes位移小于50nm(通常更小)。对于LSS蛋白，Stokes位移≥100nm。具体来说，这些蛋白质被紫外光或蓝光激发，它们发出的是绿色或红光。例如,T-Sapphire, LSSmOrange和LSSmKate．
  
  
• 荧光传感器:这些FPs会随着环境变化(如pH、Ca、Ca)而改变其激发/发射行为^2＋通量等)。最常用的是GECIs——基因编码的钙指示剂(如GCaMP)。其他包括:phorin & pHTomato (pH传感器)，HyPer (H₂O₂传感器)、ArcLight(电压传感器)、iGluSnFr(谷氨酸传感器)。还有更多的例子生物传感器可以在Addgene找到．

• 分裂FPs一些FPs(比如GFP, Venus)可以被分成两半，这两半本身就是无荧光的。如果这两部分距离很近，它们将形成完整的FP并发出荧光。分裂FPs可以用来确定两个蛋白质融合到分裂FP的一半的接近程度。这种技术也被称为双分子荧光互补(BiFC)．
  
  

选择荧光蛋白时要记住8点

1. 激发和发射(ex/em):
   • 每个FP都有其独特的ex/em峰。因此，选择您的系统可以激发的FPs，并检测发射。例如，如果你的显微镜只有两个激光，488nm和561nm，你将不能使用远红色fps。如果你没有一个过滤器，将蓝光传递到探测器/相机，那么BFPs对你没有用处。
     
     
   • 当使用多个FP时，确保它们的发射光在波长上不重叠。在许多显微镜中，滤光片不够窄，不能区分密切相关的颜色。此外，大多数FPs的发射范围很广，可以被长波长滤光片检测到(例如GFP也发射黄色光)。
     
     
   • 注意，一些FPs的组合可能会导致一个名为烦恼(荧光[或Förster]共振能量转移)。当一个FP(如CFP)的能量转移激发另一个FP(如YFP)的荧光时，就会发生FRET。FRET仅在两个FPs之间的距离<10nm时发生，在标记相互作用的蛋白时应考虑。事实上，FRET常被用来确定两种蛋白质是否相互作用。
     
     
2. 齐聚反应:第一代FPs易于寡聚。这可能影响fp融合蛋白的生物学功能。因此，建议使用单体FPs(通常以“m”作为蛋白质名称的首字母表示，如mCherry)。
   
   
3. 氧气:许多FPs(特别是来自GFP的FPs)上的发色团的成熟需要氧气。因此，这些FPs不能在缺氧环境中使用。最近，从Unagi鳗鱼中分离出来的一种新的绿色荧光蛋白被证明可以在不依赖氧气的情况下成熟，这使得它适合在厌氧条件下使用。
   
   
4. 成熟时间:成熟时间是指FP正确折叠并产生发色团的时间。这可能从翻译后的几分钟到几小时。例如，superfolder GFP (sfGFP)和mNeonGFP在37°C下可以在<10min内折叠，mCherry需要~15min, TagRFP需要~100min, DsRed需要~10h。
   
   
5. 温度:温度可影响FPs的成熟时间和荧光强度。例如，增强型GFP (EGFP)在37°C下进行了优化，因此最适合于哺乳动物或细菌的研究，而GFP^S65T更适合酵母研究(24-30°C)。
   
   
6. 亮度:亮度是测量辐射亮度的一种方法。亮度计算为消光系数和蛋白质的量子产率的乘积，除以1000。在许多情况下，亮度与设定为1的EGFP相比较。有些蛋白质非常暗淡(例如TagRFP657，其亮度为0.1)，这一点应该考虑进去。耐光性可能受到实验参数(如激发光强度、pH值或温度)的影响。
   
   
7. 耐光性:荧光分子在长时间暴露在激发光下后会褪色(即失去发光的能力)。光稳定性可短至100ms (EBFP)或长至1小时(mAmetrine1.2)。然而，对于大多数FPs来说，它是几秒到几分钟。光稳定性会受到实验参数(如激发光强度、pH值或温度)的影响。
   
   
8. pH稳定性:如果你打算在酸性环境中表达FP，这个参数是很重要的(例如酵母细胞质，微酸性，或突触囊泡)。有些FPs具有不同的ex/em光谱(例如mKeima)或随pH变化而改变荧光强度(例如pHluorin, pHTomato)。

当你计划下一个实验时，或者当你的下一个同事问你“我应该使用哪种荧光蛋白?”时，把这个清单放在手边。如果你正在寻找更多的荧光显微镜工具和技术来帮助你的工作，请前往greenfluorescentblog．

感谢我们的客座博主!

Gal Haimovich博士是阿尔伯特·爱因斯坦医学院罗伯特·辛格教授实验室的研究员。他对与基因表达有关的一切都感兴趣，特别是在RNA水平上。他认为的greenfluorescentblog.wordpress.com．

更多有用的网站和资源:

• FP指南在Addgene
  
  
• 交互式可视化荧光蛋白的性质

• 荧光光谱查看器BD生物科学。
  
  
• 荧光SpectraViewer在Invitrogen(生命技术)网站
  
  
• Evrogen光谱查看器在Evrogen
  
  
• ilovegfp-一个网站非常全面的数据表，许多FP变体
  
  
• 质粒101:绿色荧光蛋白(GFP)

三篇关于不同FPs类型的评论文章:

• Stepanenko等人。(2008)“作金宝搏app下载为生物标记物和生物传感器的荧光蛋白:在分子和细胞过程中投射彩光”咕咕叫。蛋白质。Pept。科学。9(4): 338。
  
  
• Chudakov等人。(2010)“荧金宝搏app下载光蛋白及其在活细胞和组织成像中的应用”杂志。牧师．90:1103。
  
  
• 吴等人。(2011)“研究基因表达、核金宝搏app下载定位和动力学的现代荧光蛋白和成像技术”咕咕叫。当今。细胞。医学杂志．23:310。