为了结合DNA，Cas9和其他CRISPR酶需要一个短的PAM序列邻近的目标序列在兴趣点。SpCas9的3 ' NGG PAM经常出现在富含gc的基因组中，但在你想要修改的位点附近，PAM并不总是可用。为了解决PAM问题，研究人员设计了结合不同PAM序列的替代Cas9s。现在，胡等人，在大卫刘的实验室这是一种可以识别广泛的PAMs(如NG、GAA和GAT)的酶，但也显示出更高的编辑特异性。我们很高兴了解更多关于xCas9- 这就是我们所知道的到目前为止！
为什么我们需要PAM的灵活性?
IDT估计人类基因组中每42个碱基中就有一个NGG PAM。SpCas9定位应该很容易，对吧?是的,没有。如果你只是想敲除基因，你可能会很乐意把目标定位在外显子的任何地方。但是如果你想用的话，事情会变得更复杂同源性定向修复做出精确的编辑或敲门。编辑效率急剧下降一旦你的切割部位距离插入部位超过10bp，所以如果插入部位附近没有PAM, HDR将会很困难。基本编辑，创建点突变的另一种方法，也有一个严格的编辑窗口，在帕姆的上游约15 nt。即使您的插入位点附近有PAM，也可能由于潜在的偏移网站或低预测的目标效率而受到不希望的相应GRNA。
在Cas9不起作用的情况下，还有其他选项。常用cpf1变体，具有5英尺TTTV PAM，改善富含富有基因座或基因组的靶向。来自其他物种的Cas9，喜欢S.金黄色葡萄球菌和N. Meningitidis.需要不同的PAM网站而不是SPCAS9在这种情况下，分别在这种情况下，nngrrt和nnngatt。研究人员还通过诱变PAM交互域，使用像NGAG和NGCG和NGCG和SACAS9等替代PAM一起设计SPCAS9变体。然而，这些替代的PAM序列较长并且通常比ngg更复杂，导致整体基因组频率较低。尽管我们所取得进展，但仍然需要和兴趣具有更短的PAM序列和/或更广泛的PAM灵活性。
通过定向进化创建xCas9
胡等人。利用噬菌体辅助进化产生和选择具有PAM灵活性的Cas9突变体。在该系统中，诱变质粒(MP6.）允许快速，大规模的感兴趣基因的突变。它们创建了一种选择噬菌体（SP），以将融合到细菌聚合酶亚单位ω的催化死SPCAS9（DCAS9）。该构建体设计用于激活编码噬菌体基因III的附件质粒（AP）的转录。辅助性质粒库含有与Protospacer相邻的所有64个可能的NNN PAM序列。如果ω-DCAS9可以识别库PAM，则会诱导基因III的转录，允许噬菌体传播并保持池中的DCAS9序列。根据该逻辑，识别多个PAM的Ω-DCAS9变体应在具有单个PAM识别的蛋白质上具有适应性优势。
在噬菌体繁殖24天后，Hu等人分离出xCas9 1.0-1.4，并将其置于另一个72小时的噬菌体辅助进化中，生成xCas9 2.0-2.6。这第二轮进化包括噬菌体的持续流出，增加了严格性，并促进了最广泛的靶向变异的生存。在最后一轮进化中，他们使用了一个无g PAM库，在非ngg PAM上增加Cas9变体的活性，生成xCas9 3.0-3.13。
测试XCAS9 3.0-3.13，胡等人。首先恢复催化残留物D10和H840。为了确保克隆能够切割，它们在细菌中对NNN PAM库进行测试，其中裂解导致抗斑霉素抗性的损失。XCAS9 3.7显示了最广泛的PAM范围，识别NG，NNG，GAT和CAA PAM，而XCAS9 3.6显示第二个最佳PAM系列。
在哺乳动物细胞中表征XCAS9
胡等人。将XCAS9活动与WT SPCAS9与哺乳动物细胞中的XCAS9活性进行比较，发现XCAS9 3.7显示在NGG PAM上的SPCAS9相同的编辑率。当他们测试各种NG，GAT，GAA和CAA PAM时，他们看到XCAS9 3.7以比SPCAS9更高的效率切割多个PAM：NGT（4.5倍），NGC（2.1倍），NGA（1.6-折叠）和Gaa和Gat（5.2倍）。NGA编辑效率的低增加符合前一个观察，即NGA是SPCAS9的二级PAM。
Hu等人进行了GUIDE-seq分析来描述全基因组脱靶的特征，因为增加PAM的灵活性也可能增加脱靶活性。令人惊讶的是，有NGG PAM序列的5个grna实际上都有脱靶效应较低的与SpCas9相比，xCas9为3.6/3.7。对于一些非混杂的gRNAs, xCas9 3.7显示出超过100倍的脱靶编辑减少;对于已知混杂的gRNAs, xCas9 3.7在脱靶:靶上编辑比率方面仍然显示了4.2-9.4倍的提高。重要的是，观察到的脱靶位点显示了广泛的PAM序列，这表明它们可能比SpCas9脱靶位点更难预测。
利用xCas9进行转录调控和碱基编辑
胡等人。还使用XCAS9支架工程转录激活剂。使用NGG PAM，XCAS9 3.7-VPR在激活转录时构建适度优势的SPCAS9-VPR。与NGG PAM相比，含有NG，GAA或GAT PAM的网站平均56-91％转录激活，确认XCAS9 3.7的灵活性。
xCas9的基本编辑器变体也同样灵活。与xCas9 3.7核酸酶一样，xCas9 3.7融合到第三代胞苷碱基编辑器结构(BE3)中，比SpCas9-BE3略微提高NGG PAM的编辑效率(37 vs 28%)。胞苷碱在NGT、NGC、GAA和GAT PAMs上的编辑得到改善，但NGA编辑的增加幅度较小。腺嘌呤碱基编辑器xCas9 3.7-ABE也遵循同样的模式，与含有spcas9的ABE7.10相比，NGG PAM的编辑能力有所提高(69 vs 48%)， NG和GAT PAM的编辑能力也有所提高。
3.7哺乳动物细胞的活性
构造 |
ngg pam. |
NGA PAM. |
NGC PAM. |
NGT PAM |
棉酚PAM |
手枪PAM |
XCAS9 3.7 |
41 (1) |
32 (1.6) |
13 (2.1) |
38（4.5） |
7.2 (5.2) |
|
-BE3 xCas9 (3.7) |
37（1.3） |
16 (3.5) |
6.2 (13) |
24（9.5） |
10（> 50） |
12（> 100） |
安倍xCas9 (3.7) |
69（1.4） |
43（2） |
21日(3) |
不检查 |
16 (> 100) |
|
平均编辑效率（用NGS测量的细胞群中的编辑频率）显示为百分比，与括号中的SPCAS9相比，折叠变化。
xCas9 3.6和3.7的开发表明，我们对Cas9所做的修改还只是皮毛而已。令人惊喜的是，选择一个有益的性状，PAM相容性，也产生了一个酶，提高了靶上和降低了脱靶编辑率。这种PAM灵活性应该将需要非常特定的定位(如同源定向修复和碱基编辑)的应用程序扩展到更多的位点。
虽然这些早期的数据很令人兴奋，但我们还有很多我们仍然不知道XCAS9。“我不是100％确定XCAS9比SPCAS9更好。I want everyone to test it because I want to know the answer", says Liu. We’re hoping that these answers come sooner rather than later. Once you’ve tried it, let us know how xCas9 is working for you in the comments section!
参考文献
等。“进化出具有广泛的PAM兼容性和高DNA特异性的Cas9变种。”自然（2018）DOI：10.1038 / Nature26155 PubMedPMID：29512652
- 这篇论文中的质粒是可用的在Addgene。
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
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