慢病毒是将你感兴趣的基因导入细胞的有效工具。与只能感染分裂细胞的伽马逆转录病毒不同，慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞。
Addgene有广泛收集慢病毒质粒创造了多种应用，包括cDNA表达，shrna介导的敲除，Tet和cre调控的表达，CRISPR基因组编辑，等等。毫不奇怪，我们从世界各地的科学家那里收到了许多问题，他们正在寻找关于这些载体的更多信息或澄清。请继续阅读，以找到我们最常见的慢病毒问题的答案。
这个有用的资源来自Addgene寄存者（也是慢病毒专家）的Didier Trono的实验室网页解释了慢病毒颗粒是如何通过共转染三种基本成分产生的：慢病毒包装载体、包含感兴趣基因的转移载体和编码包膜的质粒。三代慢病毒包装系统已开发多年的基础上艾滋病毒-1；然而，第一代载体从未被使用，因为它们对科学家构成了太多的生物安全风险。第二代载体可能足以用于大多数实验；然而，第三代包装系统为该技术提供了最大的生物安全性。使用第三代系统的次要限制是，它涉及将四种不同的质粒转染到产生细胞中（两种包装质粒、一种包膜质粒和慢病毒转移载体），而不是第二代系统使用的三种质粒。
常见问题
现在，让我们来了解一些细节，并回答Addgene员工最常被问到的问题:
逆转录病毒和慢病毒是一回事吗?我可以用逆转录病毒包装质粒包装慢病毒吗(反之亦然)?
A1：慢病毒是逆转录病毒家族的一部分。科学家通常称之为“逆转录病毒”的技术上是伽马逆转录病毒-逆转录病毒家族的另一个独立成员。而慢病毒和伽马逆转录病毒使用相同的基因进行包装（即gag、pol和env），这些蛋白质的亚型，以及病毒长末端重复序列（LTR）它们是不同的。因此，慢病毒和逆转录病毒包装载体是不可互换的。虽然这些差异看起来很细微，但它们导致了慢病毒和逆转录病毒之间的一个关键生理差异。慢病毒能够进入完整的核膜，使它们能够感染分裂的和非潜水的细胞，而逆转录病毒ses只能感染分裂细胞，在选择合适的基因传递系统时，需要考虑特定的靶细胞或组织。
Q2:我可以使用慢病毒转移载体进行瞬时转染吗?
A2:从技术上讲，是的。它真的有效吗？这取决于。大多数转移质粒使用弱病毒LTR启动子来驱动感兴趣基因的表达。因此，蛋白质表达水平往往比使用专门为瞬时表达设计的质粒主干时低得多（找到一些有用的主干在这里)或从病毒转导。虽然不理想，但病毒结构的瞬时表达是一个有用的工具，因为它提供了一种方法，在投入时间和资源构建稳定的细胞系之前，快速检查一个结构是功能性的。当表达一种病毒结构时，需要临时小心，以确保使用合适的细胞系;几个常见的实验室细胞系，包括293细胞系都是用腺病毒蛋白E1A永生的，该蛋白已被证明可以抑制HIV-1 ltr的表达（详情请参阅在这里)．
第二代和第三代慢病毒质粒
问题3:如何区分第二代和第三代转移载体?
A3: Addgene根据是否有嵌合的5’ltr来定义第二代或第三代转移载体。第二代转移质粒有一个野生型5’ltr，这需要Tat蛋白的存在才能工作，而第三代转移质粒有一个嵌合的5’ltr，包括一个CMV或RSV启动子以及部分5’ltr。包括一个嵌合的5'LTR消除了对HIV Tat蛋白的需求，从而降低了在目标细胞中制造复制能力慢病毒(RCL)的可能性。
Q4:第二代和第三代载体的包装系统有什么不同?这对迁移向量意味着什么?
A4:慢病毒包装系统在两个方面有所不同。首先,2钕产生系统由编码HIV蛋白gag、pol、rev和tat的包膜质粒和包装质粒组成理查德·道金斯产生系统需要一个包膜质粒和两个包装质粒，一个编码gag和pol，另一个编码rev。第二，3理查德·道金斯代包装系统修改了转移质粒的5 ' LTR，消除了对HIV Tat蛋白的需要，因此被认为更安全。
由于野生型5’ltr启动子需要Tat来发挥作用，因此第二代转移质粒必须与第二代系统包装。第三代质粒可以用任何一种系统包装。请注意，用于包装病毒的代并不改变转移载体的代。
问题5：病毒颗粒上会表达什么样的包膜糖蛋白？
A5:这取决于你使用的包膜质粒，因为包膜的选择决定了病毒的嗜性。VSV-G因其宿主范围广，粒子稳定性高而非常常见;然而，该蛋白具有细胞毒性，妨碍了慢病毒载体在生产细胞系中的长期表达。188完整比分直播识别毒性较小的包膜蛋白或靶向特定组织的包膜蛋白是目前积极研究的领域在这里)．替代信封是强大的工具，因为它们允许研究人员将转导目标定向到特定的细胞类型或组织;这在基因治疗的应用中是有用的，因为在基因治疗中，细胞群的一个不同的子集需要被靶向。
Q6:转移质粒能够复制吗?罪是什么?
A6:大多数(如果不是全部)Addgene转移质粒存在复制缺陷，这意味着它们可以用来制造能够感染目标细胞的病毒，但在最初感染后不能产生任何新的病毒颗粒。
罪恶是一种语言的简写年代精灵,在激活，通过删除转移质粒中的大部分3'LTR来实现。删除可防止靶细胞中产生全长病毒RNA，并将产生RCL的风险降至最低。此外，删除可通过限制病毒LTR增强子与靶细胞之间的相互作用来降低插入突变的风险这种相互作用不仅可以改变转基因的表达，还可以改变相邻细胞基因的表达。
Q7:哪些基因被删除或修改导致复制缺陷?以艾滋病毒为基础的病媒比例是多少?
A7:没有一个质粒包含产生病毒颗粒所需的所有成分。各组成部分划分如下:
- 转移载体包含最小的顺式作用HIV组分：LTR、PPT、RRE和psi包装信号。病毒组分的总量通常小于1.5kb，很少超过转移质粒的30%。许多转移载体是SIN。
- 包装质粒包含产生病毒所需的最少数量的HIV基因(3或4个)。第三代载体包含gag、pol和rev.第二代包含这三个基因加上tat。
- 包膜质粒为伪分型提供了异源包膜，不是hiv衍生的。
关于慢病毒转导的安全性
问题8：你提到了生物安全。慢病毒在生物安全方面的主要风险是什么？
A8:根据美国生物安全协会，“慢病毒载体的两个主要风险是:1)潜在的复制能力病毒[通常是HIV-1]的产生;188完整比分直播2)通过插入突变发生肿瘤的潜力。这些风险很大程度上是基于所使用的载体系统和载体编码的转基因插入物。”
下表列出了与慢病毒转导各方面相关的生物安全问题，以及如何降低风险的建议。
生物安全应始终考虑到正在进行的特定实验，您应了解您的机构或国家概述的此类试剂使用指南。
还有其他问题吗?请在评论中发表，我们很乐意回答!
注:A. Max Juchheim, Marcy Patrick和Meghan Rego对本文的写作有贡献。
额外的资源:
Addgene博客的资源:188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
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